無內毒素質粒大量提取試劑盒可提取 100-300ml 菌液,，采用改進的 SDS-堿裂解法裂解細胞,，通過du特的內毒素清除劑選擇性結合離心除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低 pH 值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA,。
無內毒素質粒大提試劑盒(增強型) 核酸提取

EndoFree Plus Plasmid Maxi Kit

無內毒素質粒大提試劑盒(增強型)

無內毒素質粒大提試劑盒(增強型) 核酸提取

目錄號：31113-10

產品內容：

保存條件：

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下,，可保存 12 個月,。

RNase  A,、內毒素清除劑，可常溫運輸,，-20℃保存,。

產品簡介：

無內毒素質粒大量提取試劑盒可提取 100-300ml 菌液，采用改進的 SDS-堿裂解法裂解細胞,，通過du特的內毒素清除劑選擇性結合離心除去內毒素,，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低 pH 值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA,，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除,，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫,。所得質粒可直接用于酶切,、轉化,、PCR、RT-qPCR,、測序及轉染等分子生物學實驗,。

產品特點：

1. du特工藝配方清除內毒素，內毒素含量極低（< 0.1 EU/ug DNA）,，細胞轉染效果ji佳,。

2. 得率高： 150 – 300 ml 菌液可提出多達 500– 2000 ug 的純凈質粒,。

重要提示：

一、使用前請先檢查平衡液,、溶液 P2 和溶液 N3 是否出現渾濁,，如有混濁現象，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘,，即可恢復澄清,，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫,。

二,、第一次使用前請先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入指ding量無水乙醇（見瓶身標簽）,，充分混勻,，并做好標記，以免多次加入,。

三,、shou次使用時請先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻,，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存,。

操作步驟：

1. 取 150 ~ 200 ml（最多 300ml）過夜培養(yǎng)的菌液，室溫 9,000 rpm 離心 1 min,，盡量倒干上清,，收集菌體。

（注意： 如果用 50ml 離心管收集菌體,，離心棄上清后,，在同一管內加入更多的菌液，重復步驟 1）

2. 加入 7.5 ml 溶液 P1,，重懸菌體沉淀,，渦旋震蕩至che底懸浮。

（注意：如有未che底懸浮的菌塊會影響裂解,，導致提取的質粒濃度及純度降低）

3. 加入 7.5 ml 溶液 P2,，溫和地上下翻轉 6-8 次，使菌體充分裂解,，室溫放置 4 min,。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染,，所用時間不要超過 5 min,，以免質粒受到破壞，如未wan全變得清亮，可能是菌體太多,，可增加溶液 P2 的用量,，在后續(xù)的操作中溶液 P3 的用量也要相應增加）

4. 加入 7.5 ml 溶液N3，立即溫和地上下翻轉 6-8 次,，充分混勻時會出現白色絮狀沉淀,，

然后室溫 9,000 rpm 離心 10 min,小心取上清至新管。

（注意：加入溶液 N3 后應立即混合,，避免產生 SDS 的局部沉淀）

5. 加入 0.1 體積(上清的體積的 10%,，約 2.4 ml)的內毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒

旋轉混勻,。冰浴(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘,，直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次,。

（注意：內毒素清除劑加入上清后,，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮,或稍渾濁,。）

6. 常溫放置 3 ~ 5 分鐘,，溶液很快變?yōu)闇啙幔嵉够靹颉?/span>（37℃水浴可加速渾濁）

7. 室溫 9,000 rpm 離心 10 min 分相,。上層水相含 DNA,，下層藍色油狀相含內毒素和其它雜質。將含 DNA 的上層水相（上清）轉移到新管,，棄油狀層,。

8. 加入 0.5 倍上清體積的異丙醇（約 11 ml）,充分顛倒混勻，分兩次（每次不超過 10 ml）轉入吸附柱中（吸附柱放入收集管中）,，9,000 rpm 離心 1min,，質粒被吸附在膜上，倒棄收集管中的濾液,，直到所有混合溶液通過此吸附柱,。

9. 可選步驟：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PE，室溫 9,000 rpm 離心 1 min,，棄濾液,。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無水乙醇,，用后應立即蓋緊瓶蓋,，以防酒精揮發(fā)）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α,，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1,、BL21,、 HB101、JM101 等,，此步驟不可省略,，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質粒,。如果提取低拷貝質粒也推薦采用此步驟）

10. 加入 10 ml 漂洗液 WB,，室溫 9,000 rpm 離心 1 min，棄濾液,。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液,，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋,，以防酒精揮發(fā)）

11. 重復步驟 10 一次,。

12. 將吸附柱放進收集管，室溫 9,000 rpm 離心 3 min,，甩干膜上殘留乙醇,。

13. 將吸附柱置于一個新的 50 ml 離心管（自備）中，加入 1 ~ 2 ml 的洗脫緩沖液EB,，室溫放置 2 min,，9,000 rpm 離心 2 min，離心管底溶液即質粒 DNA,。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預熱洗脫緩沖液 EB,，可增加洗脫效率；

如果需要較多量質粒,，可將得到的溶液重新加入吸附柱中,，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫,，可用 NaOH 調整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間,。）

 

無內毒素質粒大提試劑盒(增強型) 核酸提取