常規(guī)的DNA純化方式并不能有效地去除糞便中存在的大量抑制因子而導(dǎo)致下游實驗的失敗,，如PCR不能擴增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和新型du特的溶液系統(tǒng),，能有效去除動物糞便中各種影響下游實驗（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA,。
糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）

糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）

糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）

目錄號：40213

v 適用范圍：

適用于快速提取各種糞便DNA

v 試劑盒組成,、儲存,、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

雜質(zhì)清除劑AB,，短時間內(nèi)使用可以放室溫,，長期保存負-20℃。

儲存事項:

1. 緩沖液ASL或者結(jié)合液CB低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀,，可以在70℃水浴幾分鐘幫助重新充分溶解,，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

2. 雜質(zhì)清除劑AB常溫運輸,，短期一個月內(nèi)可4℃存放,，-20℃長期保存。

3. 為避免降低活性,，方便運輸,，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后,，可短暫離心后,，加入1毫升滅菌水溶解，因為反復(fù)凍融可能會降低酶活性,，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存,，－20℃保存。

4. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā),、氧化,、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子,。

v 產(chǎn)品介紹：

常規(guī)的DNA純化方式并不能有效地去除糞便中存在的大量抑制因子而導(dǎo)致下游實驗的失敗,，如PCR不能擴增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和新型du特的溶液系統(tǒng),，能有效去除動物糞便中各種影響下游實驗（如PCR）的抑制因子,，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。動物糞便樣品經(jīng)特殊緩沖液ASL重懸后，70℃處理5分鐘裂解細菌,；離心去除不溶解的雜質(zhì),，蛋白酶K消化進一步去除蛋白和雜質(zhì)；然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜,， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除,，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

v 產(chǎn)品特點：

1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口*公司特制吸附膜,，柱與柱之間吸附量差異極小,，可重復(fù)性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端,。

2. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟,。

3. 快速,，簡捷，單個樣品操作一般可在40分鐘內(nèi)完成,。

4. 多次柱漂洗確保高純度,，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值達1.7～1.9，可直接用于PCR,，Southern-blot和各種酶切反應(yīng),。

v 注意事項：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機,，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機,。

2. 開始實驗前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃?zhèn)溆谩?/span>

3. 結(jié)合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套,，避免沾染皮膚,，眼睛和衣服。若沾染皮膚,、眼睛時,，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA,， 不影響下游酶切,、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫,， 但應(yīng)該確保pH大于7.5,， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存,，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl,， 1mM EDTA，pH 8.0）,，但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng),，使用時可以適當(dāng)稀釋。

5. PCR可能被過量的DNA（一般大于1μg）抑制,，使用最小用量的洗脫DNA（適當(dāng)稀釋）反而可以得到更好的擴增,。一般加入的洗脫DNA體積不要超過總PCR反應(yīng)體積的10％。我們建議在PCR反應(yīng)體系中加入終濃度0.1 μg/μl的BSA（牛血清白蛋白）有助于得到優(yōu)良擴增效果,。

v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇,，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,，以免多次加入!

1. 收集約200-220mg糞便到一個2ml離心管,，置冰上。

如果是冰凍的標(biāo)本,，加入緩沖液ASL前不能解凍,，否則DNA容易降解。

2. 加1.4ml 緩沖液ASL,，連續(xù)渦旋振蕩1分鐘或者直到wan全混勻均一,。

注意wan全渦旋混勻，否則會嚴重降低產(chǎn)量,。

3. 將重懸物70℃溫育5分鐘,。

該加熱步驟可以提高3-5倍DNA產(chǎn)量，并且?guī)椭呀饧毦图纳x,。對于某些難裂解的細胞（如革蘭氏陽性菌）可以提高到95℃,。

4. 渦旋振蕩15秒，室溫放置1分鐘,。最高速離心1分鐘沉淀糞便顆粒,。

5. 轉(zhuǎn)移900μl上清到一個1.5ml離心管，加入100μl雜質(zhì)清除劑AB,，立刻渦旋振蕩1分鐘或者直到wan全混勻均一,，室溫放置1分鐘。最高速離心3分鐘去除雜質(zhì),。

6. 轉(zhuǎn)移所有上清到一個1.5ml離心管,，最高速離心3分鐘。

7. 轉(zhuǎn)移210μl上清到一個1.5ml離心管,，加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,，充分混勻,，加入200μl 結(jié)合液CB，渦旋振蕩15秒,，充分混勻,。70℃溫育10分鐘。

如果產(chǎn)量偏低,，可以轉(zhuǎn)移更多的上清,，并且相應(yīng)的按比例提高蛋白酶K和結(jié)合液的和后面的異丙醇使用量。

8. 冷卻后加入100μl 異丙醇,，渦旋混勻,。

9. 將上一步所得溶液和可能出現(xiàn)的沉淀都加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒,，倒掉收集管中的廢液,。

10. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒,，棄廢液,。

11. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液,。

12. 加入500μl漂洗液WB,，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液,。

13. 將吸附柱AC放回空收集管中,，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液,， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng),。

14. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中,，在吸附膜的中間部位加100－150μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液可事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱）,， 室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘,。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘,。

洗脫體積越大,，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高,，可以適當(dāng)減少洗脫體積,， 但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量,。

15. DNA可以存放在2-8℃,，如果要長時間存放，可以放置在－20℃,。

v 問題與解決方法:

 

糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）