酵母基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)

酵母基因組DNA快速提取試劑盒 核酸提取

目錄號(hào)：40210

v 適用范圍：

適用于快速提取各種酵母基因組DNA

v 試劑盒組成,、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果,。

儲(chǔ)存事項(xiàng):

1. 結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀,，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用,。

2. 為避免降低活性,，方便運(yùn)輸,，提供蛋白酶K為凍干粉狀（20mg），收到后,，可短暫離心后,，加入1毫升滅菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性,，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存,，－20℃保存。

3. 為避免降低活性,，方便運(yùn)輸,，提供Lyticase(2500U)為凍干粉狀，收到后,，可短暫離心后,，加入0.25毫升滅菌水溶解配制成10U/μl，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性,，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存,，－20℃保存。

4. 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā),、氧化,、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子,。

v 產(chǎn)品介紹：

該試劑盒采用DNA吸附柱和du有的溶液系統(tǒng),，適合于從多種來(lái)源的酵母培養(yǎng)物中快速簡(jiǎn)單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生長(zhǎng)期的酵母培養(yǎng)液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質(zhì)量的基因組DNA,。純化DNA產(chǎn)物可直接用于PCR,、酶切和雜交等實(shí)驗(yàn)。酵母細(xì)胞經(jīng)lyticase處理去除細(xì)胞壁后,，du特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶,，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟,，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物,，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫,。

v 產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界有名公司特制吸附膜,，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好,?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟,。

3. 快速,，簡(jiǎn)捷,，單個(gè)樣品裂解后操作一般可在30分鐘內(nèi)完成,。

4. 多次柱漂洗確保高純度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值達(dá)1.7～1.9,，可直接用于PCR,，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

v 注意事項(xiàng)：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成,，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī),，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。

2. 需要自備乙醇,、異丙醇,、β-巰基乙chun。 

3. 開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到37℃和70℃?zhèn)溆谩?/span>

4. 結(jié)合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,，操作時(shí)要戴乳膠手套,，避免沾染皮膚，眼睛和衣服,。若沾染皮膚,、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗,。

5. 用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨chun,，0.1M Na₂EDTA，14 mMβ-巰基乙醇),。配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解182.2克山梨chun,，加入200 ml 0.5 M Na₂EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié)PH值,，定容到1L,，4℃保存。臨用前加0.1%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M),。

6. 菌體濃度檢測(cè)一般OD600值為1的時(shí)候,釀酒酵母細(xì)胞是1-2x10⁷ cells/ml,，由于菌種和分光度計(jì)不同即使同樣細(xì)胞數(shù)量OD值變化也很大，以上僅供參考,。

7. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA,，不影響下游酶切、連接等反應(yīng),。也可以使用水洗脫,，但應(yīng)該確保批pH大于7.5，pH過(guò)低影響洗脫效率,。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃,。DNA如果需要長(zhǎng)期保存,，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA,，pH 8.0）,，但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋,。

v 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：

e 第一次使用前請(qǐng)先在15ml漂洗液WB中加入60ml無(wú)水乙醇,，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,，以免多次加入!

e 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇,，回復(fù)到室溫備用。

1. 取1-3毫升酵母培養(yǎng)物(不超過(guò)3X10⁷cells,，最好是早對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期),，12,000rpm離心30秒，盡可能的吸棄上清,，收集菌體,。

收集超過(guò)1.5毫升菌液，可以離心棄上清后,，在同一個(gè)1.5ml管內(nèi)加入更多的菌液,，重復(fù)步驟1，直到收集到足夠的菌體,。

2. 加入600μl Sorbitol buffer,，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞；可按照20-50U/1x10⁷cells的比例加入Lyticase(一般3 ml培養(yǎng)物可能需要加到150U),，充分顛倒混勻,，37℃溫育至少30分鐘消化細(xì)胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化,。

如果破壁效果不好導(dǎo)致DNA產(chǎn)量低,，可以加大lyicase用量來(lái)提高酶工作濃度，還可以延長(zhǎng)消化時(shí)間來(lái)提高效果,，不適合Lyticase消化的酵母可選用Zymolase或者其它方法如玻璃珠渦旋,，煮沸，反復(fù)凍融等,。

3. 13,000rpm離心1分鐘,，盡可能吸棄上清，加180μl 緩沖液YB充分重懸細(xì)胞團(tuán),。

4. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml),，立刻渦旋振蕩充分混勻。

5. 將混合物放置在55℃水浴消化直到消化wan全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解,。

所需消化時(shí)間和酵母數(shù)量,、種類和生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)，一般15分鐘即可,，但是如果方便的話消化過(guò)夜也無(wú)不良影響,。

可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多,，需要去除RNA,，可在完成操作步驟5后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,，振蕩混勻,，室溫放置5-10分鐘。

6. 加入200μl結(jié)合液CB,，立刻渦旋振蕩充分混勻,，70℃放置10分鐘。

7. 冷卻后加入100μl 異丙醇,，立刻渦旋振蕩充分混勻,，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

8. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中,，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒,，倒掉收集管中的廢液。

9. 加入500μl抑制物去除液IR,，12,000rpm 離心30秒,，棄廢液。

10. 加入700μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!）,，12,000rpm 離心30秒,，棄掉廢液。

11. 加入500μl漂洗液WB,，12,000rpm 離心30秒,，棄掉廢液。

12. 將吸附柱AC放回空收集管中,，13,000rpm離心2分鐘,，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng),。

13. 取出吸附柱AC,，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）,，室溫放置3-5分鐘,，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘,，12,000rpm離心1分鐘,。

洗脫體積越大，洗脫效率越高,，如果需要DNA濃度較高,，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是最小體積不應(yīng)少于50μl,，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率,，減少DNA產(chǎn)量。

14. DNA可以存放在2-8℃,，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放,，可以放置在－20℃。

v   問(wèn)題與解決方法

酵母基因組DNA快速提取試劑盒 核酸提取