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三,、操作步驟（一）取材、冰凍切片：將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉,，打開胸腔，暴露心臟,，刺破右心耳,，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛,。（見圖2-7）,。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr,。以0.1MPBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）,。將組織塊入30%蔗糖/0.1MPBS液（4℃），1-2天后冰凍切片,，將切片裱貼于原位雜交玻片上,，切片厚度為15-20μm。（二）探針制備與檢測（定量）：1.隨機引物制備cDNA核酸探針以DIGDNA標記檢測試劑盒
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原位雜交組織（或細胞）化學（InsituHybridizationHistochemistry,，ISHH）簡稱原位雜交（InSituHybridization）,，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針,，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的方法,。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交,，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類,。根據(jù)探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類,。直接法主要用放射性同位素,、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，
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標簽：限制性內(nèi)切酶消化DNA影響限制性內(nèi)切酶反應的因素很多,。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性,。這種抑制可通過增加酶作用單位數(shù)、增大反應體枳以稀釋可能的抑制劑或延長反應時間來加以克服,。實驗方法單酶單DNA樣品消化消化多個DNA部分消化實驗方法原理進行限制酶切割反應只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應緩沖液溫育,，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強度,、溫育溫度和時間都依具體的反應而改變,。實驗材料DNA試劑,、試劑盒TE酶切緩沖液EDTA儀器、耗材電泳儀實驗步驟1.混合下列溶液于一個無菌的微量離心管
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斑點和狹線印跡是一種將混合的未經(jīng)分離的面定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上進行雜交分析的簡單技術,。用來檢測被印跡的1DNA制品中靶序列的相對豐度,。實驗方法多樣抽濾法實驗材料DNA試劑、試劑盒SSCNaClNaOHTris·Cl儀器,、耗材紫外透射儀電泳儀多樣抽濾加樣器實驗步驟1.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的尼龍膜,，將膜置于6×SSC的表面讓其自然浸沒。放置10min,。2.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的Whatman3MM濾紙,，用6×SSC浸濕。3.將Whatman3MM濾紙置于多樣抽濾加樣器上,，將膜
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*節(jié)概述質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點,。如果要克隆較小的DNA片段（＜10kb）且結構簡單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好,。在質(zhì)粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段,然后體外使兩者相連接,再用所得到重組質(zhì)粒轉化細菌,即可完成,。但在實際工作中,如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的,。通過調(diào)整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如
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采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進行酶切以獲得相應的粘末端進行連接,。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切,。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同,，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切,，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進行低鹽要求的酶酶切,，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求,，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩沖液進行雙酶切,。具體要根據(jù)酶的反應要求進行,，盡量避免星號活力。一材料,、試劑和儀器：1材料：質(zhì)粒DNA
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甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）甲基化是目前的研究熱點,，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享,。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?部分基因組DNA的提取,。這一步?jīng)]有懸念，*可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒,，如果實驗室條件成熟,，自己配試劑提取*可以,。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力,，提出的基因組DNA應該是完整的,。此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA,、蛋白的污染很重要,。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。使用兩者的細節(jié)：1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水
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一,、原理：在濃氯化鈉（1―2mol/L）溶液中,，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小,，在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小,，核糖核蛋白的溶解度很大,。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液,，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來,。將抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，DNA或（RNA）即與蛋白質(zhì)分開,，可用氯仿―異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去,，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇,，DNA即析出,。為了防止DNA或（RNA）酶解，提取時加入EDT
