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三、操作步驟

（一）取材,、冰凍切片：

將動(dòng)物以3%戊巴比妥鈉麻醉,，打開(kāi)胸腔，暴露心臟,，刺破右心耳,，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動(dòng)物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛,。（見(jiàn)圖2-7）,。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr,。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）,。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片,，將切片裱貼于原位雜交玻片上,，切片厚度為15-20μm。

（二）探針制備與檢測(cè)（定量）：

1.  隨機(jī)引物制備cDNA核酸探針以DIG DNA 標(biāo)記檢測(cè)試劑盒為例：

（1）探針制備：

①模板DNA（0.5-3 μg） 15 μl,，100℃變性10 min,，冰浴5 min。

②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2 μl,， dNTPmix 2 μl,，Klenow Enzyme 1 μl，反應(yīng)總體積為20 μl,。37℃孵育過(guò),。

③在上述20 μl 的標(biāo)記產(chǎn)物中加4 M LiCl 2.5 μl,，75 μl（無(wú)水乙醇預(yù)冷，輕輕混勻,，-20℃放置 2 hr,。4℃離心12 000 g×15 min，棄上清,。70%乙醇（預(yù)冷） 50 μl 洗滌,，7 500 g×5 min，棄上清,，晾干沉淀,，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）探針敏感性檢測(cè)：

①樣品稀釋?zhuān)喝ig-標(biāo)記探針1 μl 用ddH₂O以1：10,、1：100,、1：1000、1：1000,、1：10000梯度稀釋,。

②取一張與點(diǎn)樣器大小相近的尼龍膜，標(biāo)記方向,，ddH₂O中浸泡 1 min,，6×SSC中浸泡10 min，置點(diǎn)樣器上,，負(fù)壓抽吸5 min,。

③將上述樣品點(diǎn)于尼龍膜上，繼續(xù)抽吸10 min,。

④取下尼龍膜,，置紫外燈下10 cm 處照射5 min，晾干,。

⑤將膜置于適量預(yù)雜交液（5-10 ml）中,，37℃預(yù)雜交10 min。

⑥加入Anti-dig 抗體（1：5000）,，37℃雜交30 min,。

⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。

⑧顯色：15 ml TSM2中加300 μl 顯色液（NBT/BCIP）,，37℃避光顯色30 min,。

2.  PCR法制備cDNA核酸探針：

（1） 探針制備：

以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：

在0.5 ml 離心管中，依次加入：

PCR引物 1（10 pM） 2 μl,；

PCR引物 1（10 pM） 2 μl,；

質(zhì)粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；

PCR DIG mix 2 μl （含dNTP和DIG-11-dUTP）,；

dNTPmix 2 μl,；

10×PCR buffer 5 μl,；

Taq 酶（2 u/μl） 1 μl；

加入適量ddH₂O,，使總體積達(dá)50 μl,。

① 將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增,。
一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃ 60 s,，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7 min,。

② 在上述PCR產(chǎn)物中加入4 M LiCl 12.5 μl,、預(yù)冷無(wú)水乙醇375 μl，輕輕混合后置于-20℃2 h,，12 000g×15 min,，棄上清。70%乙醇（預(yù)冷） 120 μl 洗滌沉淀,，離心7500g×5 min,，棄上清，晾干沉淀,，加TE 50 μl 溶解,，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）探針檢測(cè)：

行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測(cè)法）,。

（三）原位雜交反應(yīng)（以DIG-cDNA探針為例）：

1.  0.1 M PBS （pH 7.2） 浸 5-10 min,。

2.  0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。

3.  0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min,。

4.  0.1 M PBS 洗 5 min×3次,，加蛋白酶K（1 μg/ml），37℃孵育30 min,。

5.  4%多聚甲醛浸5 min,。

6.  0.1 M PBS 洗 5 min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min,。

7.  預(yù)雜交：滴加適量預(yù)雜交液,，42℃ 30 min。

（1）雜交：傾去預(yù)雜交液,，在每張切片上滴加10-20 μl 雜交液（將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中,，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?2℃ 過(guò),。

（2）洗片：

4×SSC,、2×SSC,、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min,；

0.2×SSC 37℃洗10 min,；0.2×SSC與0.1 M PBS各半洗10 min；

0.05 M PBS 洗 5 min×2次,。

10.  3% BSA/0.05 M PBS 包被,，37℃ 30 min。

11.  滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò),。

12.  0.05M PBS洗15 min×4次,；TSM1 10 min×2次； 新鮮配制TSM2 10 min×2次,。

13.  顯色：在玻片上滴加適量顯色液,，4℃避光過(guò)。

14.  將玻片置于TE中10-30 min以終止反應(yīng),。酒精梯度脫水,、二甲苯脫脂，中性樹(shù)膠封片,。

15.  顯微鏡下觀察結(jié)果,。

四、注意事項(xiàng)：

1.  作為DNA-RNA的雜交,，需防RNase的污染,。

2.  cDNA探針在雜交時(shí)必須變性解鏈。具體方法是：將探針置100℃加熱5 min,，冰浴驟冷