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經(jīng)驗(yàn)分享：1.原代細(xì)胞鋪満瓶底后棄原液,，PBS沖洗2次,。2.加入0.25%Trypsin-0.02%EDTA,量覆蓋瓶底即可，室溫作用,，鏡下觀察至組織塊周圍的細(xì)胞回縮,，立體感增強(qiáng)。3.棄去消化液,，PBS輕漂一遍(目的是除去EDTA,，它對脆弱的原代細(xì)胞很不好)但不要用力搖晃，以免部分消化稍過的細(xì)胞流失,。4.加入培養(yǎng)液吹打,，不要產(chǎn)生氣泡，對細(xì)胞有損,。5.吸出2/3的懸液傳入新瓶,。6.向原瓶中余下的1/3細(xì)胞懸液中補(bǔ)加2/3的新培養(yǎng)液，與未消化的組織塊繼續(xù)培養(yǎng),。7.24小時(shí)內(nèi)新的細(xì)胞又從組織塊中爬出啦
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體外細(xì)胞的原代培養(yǎng),、凍存和復(fù)蘇,，傳代培養(yǎng)
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個(gè)脾細(xì)胞。2.細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁,，并開始生長,，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層,。3.一般情況,，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層,，需要再次進(jìn)行傳代,。四、注意事項(xiàng)1.取材要求新鮮,，無菌,，解剖小鼠時(shí)，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器,，尤其是腸道等,，防止污染脾臟。2.沖洗脾臟時(shí)要盡量洗凈血污,，去除無用組織,，并要防止組織干燥。3.碾磨后及時(shí)用清水沖洗篩網(wǎng),，防止組織,、細(xì)胞阻塞網(wǎng)孔。4.計(jì)數(shù)前 -
體外細(xì)胞的原代培養(yǎng),、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇2
一,、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,，則需要做再培養(yǎng),，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個(gè)容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng),，為傳代培養(yǎng),，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力,。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMSO作保護(hù)劑,，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少 -
1.如果擴(kuò)增曲線ct值比較靠后的話,，32左右，一般有什么方法解決沒有ct值比較靠后,，對實(shí)驗(yàn)有一定的影響,，因?yàn)榻?jīng)過那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降,，這時(shí)候擴(kuò)增效率會(huì)有所改變（而定量PCR的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴(kuò)增效率我們認(rèn)為是確定的一個(gè)值）,。因此能夠把ct值往前移。解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解,。2.為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴(kuò)增出目的條帶,，而內(nèi)參用同樣體系就沒有呢?引物被污染。3.實(shí)時(shí)定量PCR,，熒光定量PCR,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，real－timePCR
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實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟1
1樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細(xì)胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解,。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的仿，蓋緊管蓋,。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘,。離心后混合液體將分為下層的紅色酚仿相，中間層以及無色水相上層,。RNA全部被分配于水相中,。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,，混勻后15到30℃孵育10 -
實(shí)驗(yàn)原理在細(xì)胞核中，DNA是環(huán)狀附著在核基質(zhì)上,，細(xì)胞裂解過程中,，核基質(zhì)被溶解、抽提,，DNA的結(jié)構(gòu)則未發(fā)生變化,。如果DNA鏈上存在缺口,，則使DNA超螺旋變的松弛，DNA環(huán)向外展,，同時(shí)由于暴露了陰電荷,，在電場力的作用下，松動(dòng)的DNA環(huán)向陽極遷移,，但是由于這種松動(dòng)的DNA環(huán)一端仍附著于核DNA,，其遷移距離受到限制，因此尾長并不總是真實(shí)反映鏈缺口的多少,。實(shí)際應(yīng)當(dāng)依靠尾長與尾部的熒光強(qiáng)度同時(shí)來進(jìn)行分析,。實(shí)驗(yàn)步驟1.分離制備單細(xì)胞懸液：1)體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液,；2)體內(nèi)臟器細(xì)胞：處
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實(shí)驗(yàn)原理免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術(shù),，這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM,IgG,IgA含量水平的實(shí)驗(yàn)方法。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中,，首先利用蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷的比值運(yùn)用水平瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,，然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗體的擴(kuò)散過程中,，抗原和抗體適當(dāng)比例的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致沉淀的產(chǎn)生,。0.85%鹽不僅可以終止擴(kuò)散過程也可用于洗去未結(jié)合的蛋白，抗原和抗體結(jié)合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察,。免疫電泳技術(shù)不僅可用于血清或
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實(shí)驗(yàn)原理生物大分子如蛋白質(zhì),、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中．它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H濃度或與其他大分子的相互作用,。在電場中,，帶電顆粒向陰極或陽極遷移．遷移的方向取決于它們帶電的符號．這種遷移現(xiàn)象即謂電泳。遷移的方式目前可以根據(jù)分子尺寸大小,、分子所帶的電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性分為三類,。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個(gè)沒有干擾的電場中，使顆粒具有一定遷移速率的驅(qū)動(dòng)力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E,。它們與介質(zhì)的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中,，這種抗衡服從斯托克斯定律。f=6πrvη這里v是
