聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機商鋪
實驗原理
生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸,、多糖等常以顆粒分散在溶液中．它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H 濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中,，帶電顆粒向陰極或陽極遷移．遷移的方向取決于它們帶電的符號．這種遷移現(xiàn)象即謂電泳,。遷移的方式目前可以根據(jù)分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學與化學特性分為三類,。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中,，使顆粒具有一定遷移速率的驅(qū)動力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E。它們與介質(zhì)的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中,，這種抗衡服從斯托克斯定律,。f=6πrvη 這里v是在介質(zhì)粘度為η半徑為r的顆粒的移動速度。但在凝膠中,，這種抗衡并不*符合斯托克斯定律,。f還取決于介質(zhì)小的其他因子，如凝膠厚度,、顆粒尺寸,、甚至介質(zhì)的內(nèi)滲率等。簡言之電泳就是帶電顆粒在電場中定向移動,。
銀染顯色的原理是用甲醛將沉積在DNA帶上的銀離子（硝酸銀）還原成金屬銀而顯帶,。
實驗試劑
1. 聚丙烯酰胺（C=30% T=5%）：丙烯酰胺 28.5g 、 N,，N’-二甲基雙丙烯酰胺 1.5g,、DDH2O 100ml；
2. 7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺 23.3ml,、10ml 10×TBE溶液,、66.7ml DDH2O；
3. 10×TBE溶液：Tris 113g ,、硼酸 55g,、 1000ml DDH2O；
4. 1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml,，900ml DDH2O,；
5. 10%乙醇；
6. 0.1%硝酸,；
7. 0.2%AgNO3：
8. AgNO3 0.15g,、DH2O 225ml；
9. 30%NaCO3-甲醛：NaCO3 30g,、甲醛 0.85ml,；
10. 0.1% AgNO3：AgNO3 1g、1000ml DH2O,；
11. 上樣緩沖液：0.25％二甲苯氰藍,、0.25％溴酚藍；
12. TEMED,；
13. 10％過硫酸胺：過硫酸胺1g,、10ml DDH2O。
實驗設備
1. 垂直電泳儀
2. 垂直電泳槽
3. 玻璃
4. 橡膠?？?/p>
5. 點樣梳
6. 搖床
7. 微量進樣器
8. 染色托盤
實驗材料
PCR擴增產(chǎn)物
實驗步驟
1. 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板,，自來水反復沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，烘干,，將兩塊玻璃裝入恰當?shù)孪鹉z?？騼?nèi)，并組裝好電泳槽（帶長玻璃的貯液槽為正極,，帶短玻璃的貯液槽為陰極）,。
2. 制膠：加 35μl TEMED和300μl2.5％過硫酸胺至7％聚丙烯酰胺溶液中混勻。以60O角,，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中,，直至灌滿模具頂部。立即插入相應的點樣梳,，（小心勿使梳齒下帶進氣泡,，并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi)，留約2mm梳齒于玻璃板上端,，以免拔梳時把膠孔拔斷）,。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應小心添加些膠液于梳子處,，水平放置,，室溫聚合1小時。向電泳槽內(nèi)灌入 1×TBE電泳緩沖液,。小心取出點樣梳,，用槽內(nèi)的緩沖液反復沖洗點樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡,。
3. 加樣：取2-4μl擴增產(chǎn)物和2μl上樣緩沖液混勻,用微量進樣器小心加入樣品槽中,。若DNA含量偏低,則可適當增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。
4. 電泳：電泳槽接上電極開啟電源,，根據(jù)擴增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小,，決定電泳的電壓及電泳時間。通常室溫下以l～5V／cm電泳,。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳,。
5. 銀染法顯色：
1) 方法一：
a. 將PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用純水洗一次,；
b. 0.1%硝酸3min,，蒸餾水洗兩次。
c. 0.2% AgNO3溶液中10min,，用去離子水洗三次,；
d. 用30% NaCO3-甲醛溶液顯色至滿意為止，用適量10%冰乙酸終止顯色,。
2) 方法二：
a. 取下凝膠,，蒸餾水清洗凝膠30秒,；
b. 0.1% 硝酸銀染色10分鐘；
c. 棄去染色液,，蒸餾水洗膠兩次,；
d. 顯色液（顯色液配方：10g NaOH 0.2g Na2CO3 2ml甲醛溶液，定溶到 500ml）顯色至滿意為止,。
6. 分型：參照基因階梯的電泳譜帶進行分型。
注意事項
1. 每加完一個樣品要清洗微量進樣器,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿,。
2. 以二甲苯氰藍和溴酚藍的位置大致判斷泳動距離,，7％聚丙烯酰胺非變性膠中溴酚藍相當于170bp的泳動距離，二甲苯氰藍相當于40bp的泳動距離,。
3. 銀染時顯色液配制好在4-10 ℃預冷可以減輕膠板的底色,，銀染后膠板在水中漂洗時間控制在10s以內(nèi)。
