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實(shí)驗(yàn)原理
在細(xì)胞核中，DNA是環(huán)狀附著在核基質(zhì)上，細(xì)胞裂解過程中,，核基質(zhì)被溶解、抽提,，DNA的結(jié)構(gòu)則未發(fā)生變化,。如果DNA鏈上存在缺口，則使DNA超螺旋變的松弛,，DNA環(huán)向外展,，同時(shí)由于暴露了陰電荷，在電場力的作用下,，松動(dòng)的DNA環(huán)向陽極遷移,，但是由于這種松動(dòng)的DNA環(huán)一端仍附著于核DNA，其遷移距離受到限制,，因此尾長并不總是真實(shí)反映鏈缺口的多少,。實(shí)際應(yīng)當(dāng)依靠尾長與尾部的熒光強(qiáng)度同時(shí)來進(jìn)行分析。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 分離制備單細(xì)胞懸液：
1) 體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化,，吹打成單細(xì)胞懸液,；
2) 體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物，取出臟器,，于Hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液,。
2. 膠板制備：
1) 取20~50μl于56℃水浴中保溫的0.5%普通熔點(diǎn)瓊脂糖,，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠,。
2) 取100~150μl 0.5%普通熔點(diǎn)瓊脂糖加在底膠上,，再于其上加蓋玻片，4℃冷凝10分鐘,。
3) 取下蓋片,，取50~100μl于37℃水浴中保溫的1.0%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與50~100μl細(xì)胞懸液(105個(gè)細(xì)胞/ml)混勻，立即鋪片,，加上蓋玻片,，4℃冷凝10分鐘。
4) 去掉蓋玻片,，取70~100μl于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪片,，加蓋玻片，4℃冷凝,。
3. 細(xì)胞裂解與電泳：
1) 將制備好的膠板去掉蓋玻片后,，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，4℃裂解1小時(shí),。
2) 取出膠板,，放入電泳槽中，浸泡在電泳液中解旋20分鐘,。
3) 4℃電泳20分鐘(25V,，300mA)。
4. 中和與染色：
1) 電泳結(jié)束,，將膠板浸泡于中和液中,，每次15分鐘，共中和兩次,，注意更換中和液,。
2) 取出膠板，置于染色架上,，滴加5μg/ml的PI，暗處染色20分鐘,。
3) 蒸餾水脫色15分鐘,。
5. 鏡檢和分析：
1) 在熒光顯微鏡下觀察，綠光激發(fā)吸收濾片590nm,。必要時(shí)照相記錄,。
2) 記數(shù)觀察的細(xì)胞，記錄彗星細(xì)胞出現(xiàn)的頻率,，用目鏡測微尺測頭長與全長,，計(jì)算核DNA遷移距離,。
使用兩層凝膠法，經(jīng)裂解,、DNA解旋,、電泳和中和得到濕瓊脂糖凝膠片。將濕瓊脂糖凝膠片置于冰冷無水乙醇中脫水10分鐘,，后置于空氣中自發(fā)干燥,。全部操作在采血后8小時(shí)內(nèi)完成，操作過程中注意避光,。使用50µl 30µM的溴乙錠溶液染色,、照相。使用單細(xì)胞凝膠電泳軟件分析所有照片,，隨機(jī)測量100個(gè)以上細(xì)胞的尾長和olive尾矩,，以尾長和olive尾矩的算術(shù)均數(shù)代表個(gè)體DNA損傷情況。
