聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切,。單酶切操作比較簡單,，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應(yīng)溫度不同，這時(shí)可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切,，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切,；2）先進(jìn)行低鹽要求的酶酶切,，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求，加入第二種酶進(jìn)行酶切,；3）使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切,。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進(jìn)行，盡量避免星號(hào)活力,。
一 材料,、試劑和儀器：
1 材料：質(zhì)粒DNA
2 試劑：限制性內(nèi)切酶、ddH2O
3 儀器：微量移液槍,，離心機(jī),，水浴鍋， 電泳儀,，紫外透射觀測儀
實(shí)驗(yàn)程序：
I. .單酶切：
II. 雙酶切：
注：酶切的選擇原則一般是盡量擴(kuò)大酶切體系,，這樣抑制因素得以稀釋；基因組DNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大,，一般為1μg/10U;所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10,，否則濃度會(huì)超過5%，會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力,；對難切的質(zhì)?；蚧蚪MDNA應(yīng)延長反應(yīng)時(shí)間4―5hr, 甚至。滅火限制性內(nèi)切酶活性可以采用加熱滅活,，乙醇沉淀,，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法,，具體每一種酶可能有些方法不能*滅活,，這一點(diǎn)需要注意。
二. 結(jié)果與分析：
圖1 重組質(zhì)粒HindIII XbaI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析
假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個(gè)酶切位點(diǎn), 且酶切*,，紫外燈下檢測電泳結(jié)果, 則單酶切應(yīng)為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶,。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不*。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣（超螺旋,、線性和開環(huán)三條帶）,，則說明質(zhì)粒*沒有被切開。
M1 ： λ DNA/ HindIII M2：DL2000 1 - 6: 重組質(zhì)粒HindIII XbaI
重組質(zhì)粒用HindIII XbaI雙酶切后釋放出插入片斷,，因此空載體處于同一水平位置,，而插入片斷長度分別為0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。
