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采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進行連接,。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切,。單酶切操作比較簡單,，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應(yīng)溫度不同,，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切,，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切,；2）先進行低鹽要求的酶酶切,，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求，加入第二種酶進行酶切,；3）使用通用緩沖液進行雙酶切,。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進行,，盡量避免星號活力。
一 材料,、試劑和儀器：
1 材料：質(zhì)粒DNA
2 試劑：限制性內(nèi)切酶,、ddH2O
3 儀器：微量移液槍，離心機,，水浴鍋,， 電泳儀，紫外透射觀測儀
實驗程序：
I. .單酶切：
II. 雙酶切：
注：酶切的選擇原則一般是盡量擴大酶切體系,，這樣抑制因素得以稀釋,；基因組DNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大，一般為1μg/10U;所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10,，否則濃度會超過5%,，會產(chǎn)生星號活力；對難切的質(zhì)?；蚧蚪MDNA應(yīng)延長反應(yīng)時間4―5hr, 甚至,。滅火限制性內(nèi)切酶活性可以采用加熱滅活，乙醇沉淀,，酚/氯仿抽提,，添加EDTA或SDS等方法，具體每一種酶可能有些方法不能*滅活,，這一點需要注意,。
二. 結(jié)果與分析：
圖1 重組質(zhì)粒HindIII XbaI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析
假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個酶切位點, 且酶切*，紫外燈下檢測電泳結(jié)果, 則單酶切應(yīng)為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶,。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不*,。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環(huán)三條帶）,，則說明質(zhì)粒*沒有被切開,。
M1 ： λ DNA/ HindIII M2：DL2000 1 - 6: 重組質(zhì)粒HindIII XbaI
重組質(zhì)粒用HindIII XbaI雙酶切后釋放出插入片斷，因此空載體處于同一水平位置,，而插入片斷長度分別為0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb,。
