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甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）
甲基化是目前的研究熱點(diǎn),，就我所做的一點(diǎn)工作并其中一點(diǎn)心得,，與大家分享,。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?br />
*部分 基因組DNA的提取,。
這一步?jīng)]有懸念,，*可以購買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒,，如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟,，自己配試劑提取*可以,。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力,，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的,。
此步重點(diǎn)在于DNA的純度，即減少或避免RNA,、蛋白的污染很重要,。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細(xì)節(jié)：
1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml,；
2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶,，即在購買市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml,。否則可能的后果是不僅沒有RNA,，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存,。
驗(yàn)證提取DNA的純度的方法有二：
1：紫外分光光度計(jì)計(jì)算OD比值,；
2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
我傾向于第二種方法,，這種方法*可以明確所提基因組DNA的純度,，并根據(jù)Marker的上樣量估計(jì)其濃度，以用于下一步的修飾,。
第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA
如不特別指出,，所用雙蒸水（DDW）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。
1：將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul,；
2：加5.5ul新鮮配制的3M NaOH,；
3： 42℃水浴30min；
水浴期間配制：
4：10mM對苯二酚（氫醌）,，加30ul至上述水浴后混合液中,；（溶液變成淡黃色）
5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000）,，配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋,，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，zui終體積為5ml,。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶,，但加入NaOH后會(huì)慢慢溶解，需要有耐心,。PH一定要準(zhǔn)確為5.0,。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以鋁箔紙,，避光,，輕柔顛倒混勻溶液。
7：加200 ul 石蠟油,，防止水分蒸發(fā),，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h,。
一般此步在4pm開始做,，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收,，時(shí)間上很合適,。
這一步細(xì)節(jié)：
1：基因組DNA的量不需十分，寧多勿少,，因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失,，且此方法修飾zui多可至4ug。
2：所有試劑均須新鮮配制,，所以配液的技術(shù)要過關(guān),，既要快，又要,。
3：亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性,，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收,。
4：水浴達(dá)16小時(shí),，雖可以短至8小時(shí)，但后者修飾會(huì)有不*,。
