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如何高效將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至293細胞系2023/8/7
關(guān)于293細胞系293細胞(人胚腎細胞)系包括AAV293,、HEK293,、293T293F、293A等細胞株,，是進行病毒包裝和重組蛋白表達最為常用的工程細胞之一,。特別是AAV293細胞，目前已成為腺相...
如何提高 RT-PCR 反應的靈敏度與特異性2023/6/30
1.首先確定模板RNA完整性好,，無DNA污染,。2.RNA模板中不應含有擴增反應抑制劑。3.為了防止模板降解,，在反應體系中加入RNase抑制劑RNasin,。4.使用適量的模板RNA，模板量太多會降低特異...
避免 RNA 降解的方法以及RNA 中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時的處理2023/6/30
避免RNA降解的方法：1.在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA,。2．使用良好無污染技術(shù)分離RNA,。3.將組織從動物體取出后立刻提取RNA，并將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行低溫保存,。RNA中...
RT-PCR的靈敏度低2023/6/30
可能原因1：RNA問題（包括：RNA被損害和降解,；初始模板RNA不充分）。解決方法：如果全損害或者降解的話,，更換RNA,；增加模板RNA的濃度；使用10ng-1μg的總RNA?？赡茉?：儀器故障,。解決...
RT-PCR的非特異信號2023/6/30
可能原因1：引物問題（包括：引物二聚體太多）。解決方法：檢查引物設計環(huán)節(jié)和合成環(huán)節(jié),，必要時重新設計和合成引物,。可能原因2：擴增酶問題,。解決辦法：選擇hotstartTaq酶進行擴增,，可提高靈敏度，增加...
RT-PCR的無擴增產(chǎn)物2023/6/30
可能原因1：引物問題（包括：引物設計較差,，引物合成較差,，引物濃度太低）,。解決方法：設計引物的時候,，避免在引物3'端含有互補序列；避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列,；設計Tm類似的引物,。針對引物合成的問題，...
消滅 PCR 非特異性擴增的方法2023/6/28
非特異性擴增,，即進行PCR所擴增出來的條帶不是所要的,，引物與模板在非目的條帶處有錯配，導致延伸產(chǎn)物不是目的條帶,。例如引物二聚體,，即引物在退火過程中產(chǎn)生了hairpin結(jié)構(gòu)或其他二級結(jié)構(gòu)，或者引物在模板...
DNA 復制需要哪些元素2023/6/28
1)需要脫氧核苷三磷酸：進行DNA合成必須具備的2個關(guān)鍵底物之一,，即4種脫氧核苷三磷酸——dGTP,、dCTP、dATP,、dTTP,。通常商品化PCR酶會提供這4種脫氧核苷三磷酸的混合物dNTP。2)需要...
miRNA 成熟過程中的關(guān)鍵性酶和蛋白2023/6/27
RNApolymeraseII：一般認為miRNA基因由RNApolymeraseII轉(zhuǎn)錄而來,?？蓪iRNA基因轉(zhuǎn)錄成5'端蓋帽m7G和3‘端加尾polyA結(jié)構(gòu)。Drosha：Drosha蛋白為RN...
lncRNA 的生物學功能（二）2023/6/27
一）lncRNA對于細胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報道,，lncRNA可以通過調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡的方式,，來影響細胞的增殖。例如,，Gas5（growtharrest-specific5,，非編碼RNA）在細...
lncRNA 的生物學功能（一）2023/5/17
（一）lncRNA對于細胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報道，lncRNA可以通過調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡的方式，來影響細胞的增殖,。例如,，Gas5（growtharrest-specific5，非編碼RNA）在...
構(gòu)建載體2023/5/5
構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設計引物引入酶切位點,，一旦引物設計好,，那接下來就非常簡單了，今天重點就來教教大家如何利用snapgene輕松獲得構(gòu)建載體所需的引物序列,。1.打開軟件,，選擇第一個（紅線標記），然...
引物設計原則2023/5/5
1）擴增產(chǎn)物長度100bp-150bp為佳,；2）引物長度17bp-25bp最好,；3）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超過1℃。Tm值調(diào)整至60℃-65℃為佳,；4）引物的GC含量控制在40%-60...
PCR 操作中必知的 6 大細節(jié)2023/5/5
1,、最好使用一次性進口tip頭，以避免液體殘留,；同時,，tip頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染,。2,、加樣時，tip頭要伸入PCR反應管的液面下一點,，然后將液體緩緩打入液面下,，至恰好打出一個小氣...
PCR 引物設計2023/5/5
好的引物會讓PCR實驗成功一半，因而,，引物設計一直都是PCR非常重要的環(huán)節(jié),。經(jīng)典之法就是讓Premier5攜手oligo，共同設計PCR引物,。1,、以小鼠的IL-17為例，進入NCBI界面,選擇Nucl...
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