簡介：

  小鼠肝癌細胞H22（武漢普諾賽）又稱Hepatoma-22或Hepatoma 22,，其分離自Balb/c小鼠腹水,，由大連醫(yī)科學院建立,。H22細胞為懸浮細胞,，細胞形態(tài)呈淋巴母細胞樣,。H22細胞常用于小鼠肝癌組織造模,，在評估抗腫瘤藥物的療效、探究腫瘤微環(huán)境對肝癌進展的影響,、揭示肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制等方面的研究中有著廣泛應用,。

主要耗材及儀器：

 15ml離心管,、50ml離心管、凍存管,、巴氏滴管,、培養(yǎng)瓶、封口膜,、CO2培養(yǎng)箱,、離心機、顯微鏡,、生物安全柜,、RPIM-1640、胎牛血清（FBS）,、青-鏈霉素（雙抗）,、二甲基亞砜（DMSO）等等。

培養(yǎng)流程：

 1. 細胞復蘇

1)用酒精棉球擦拭生物安全柜臺面,，準備好所需耗材,，紫外30min，與此同時打開37℃恒溫水浴箱對所用試劑進行溫浴,，同時也為復蘇細胞做準備,；

2)按照RPIM-1640+10%FBS+1% P/S的比例配制（血清）細胞培養(yǎng)基，吹打混勻后按10倍細胞的體積（嚴格來講是10倍細胞的體積,，實際操作中適當減少用量對細胞并無影響）分裝至15ml離心管中（最好依據(jù)所要復蘇細胞的量提前計算要配制的完培用量及所用離心管的數(shù)目）,；

3)從液氮拿出H22細胞，在37℃恒溫水浴箱中快速晃動使其溶解（“快溶"）,，并將其轉(zhuǎn)移至提前分裝有完培的離心管中,，吹打混勻；

4)1200rpm,，離心3min,；

5)棄去廢液，重新加入新的完培,，重懸細胞后將其加入培養(yǎng)瓶中（完培的用量視培養(yǎng)瓶大小而定，25cm²用量3-5ml,；75cm²用量10-15ml）;

6)蓋上培養(yǎng)瓶蓋子,，以劃“十字"的方式晃動培養(yǎng)瓶，以使細胞分布均勻,，鏡下觀察細胞均勻分布,，置于37℃，5%-10% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),，完成細胞復蘇,。

2. 細胞傳代

1)鏡下觀察細胞的生長情況,，待細胞生長至80%以上時即可進行傳代；

2)收集培養(yǎng)瓶中的細胞至15min離心管中,，1200rpm,，離心3min，棄去上清,；

3)等待離心的過程中,，取出T25培養(yǎng)瓶（此時培養(yǎng)瓶數(shù)應為之前培養(yǎng)瓶數(shù)的兩倍哦），做好標記,，并分別加入4ml（血清）細胞培養(yǎng)基,；

4)離心結(jié)束后棄去上清，向細胞沉淀中加入2ml完培,，輕輕吹打重懸細胞,，混勻后各取1ml細胞懸液分別加入新培養(yǎng)瓶中，蓋上蓋子,，混勻置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可完成H22細胞傳代,。

3. 細胞凍存

1)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)移細胞至15ml離心管中,，1200rpm,，離心3min；

2)等待離心的過程中,，按照55% RPIM-1640+40% FBS+5% DMSO的比例配制凍存液,；

3)離心結(jié)束后，棄去上清,，向離心管中加入凍存液（凍存液用量視分裝的管數(shù)而定）,，重懸細胞，分裝于凍存管中,，做好標記并封口,；

4)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍"），置于-80℃冰箱中,，第二天即可拿出細胞置于液氮罐中保存,。

四、注意事項

1．一定要有無菌意識,，以防細胞被污染,，實驗者雙手及所有物品在進入生物安全柜和培養(yǎng)箱前均應用75%乙醇進行表面消毒；

2．復蘇細胞時,，不可讓水浴鍋的水位沒過凍存管管口,，凍存管中僅剩一小塊冰塊時即可從水浴鍋中拿出，用其余溫使其融化,；

3．生物安全柜在使用前后要用75%乙醇擦拭消毒,，并紫外30min,；

4．重懸細胞時動作一定要輕柔，以防對細胞造成機械性損傷,；

5．操作過程中手部不要從培養(yǎng)瓶瓶口,、離心管管口等部位經(jīng)過；

6．生物安全柜最好嚴格按照清潔區(qū)-半污染區(qū)-污染區(qū)進行分區(qū),，以免造成污染,。

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