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06 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：染色體GTG標(biāo)本制備

一,、原理非顯帶染色體除可根據(jù)形態(tài)分辨部分染色體，其他多數(shù)染色體難以確認(rèn),，而顯帶技術(shù)則可使染色體縱向長(zhǎng)度上出現(xiàn)不同帶紋,，以辨認(rèn)全部染色體。GTG即G帶,，Trypsin（胰酶）,，Giemsa的簡(jiǎn)寫(xiě)。Giemsa染料是噻嗪——曙紅染料,，染色體的著色有賴于在原位形成噻嗪--曙紅（2∶1）的沉淀物,。著色首先取決于二個(gè)噻嗪分子同DNA結(jié)合，在此基礎(chǔ)上再結(jié)合一個(gè)曙紅分子,，其次取決于一個(gè)疏水環(huán)境,，以利于染料沉淀而著色。通過(guò)胰酶的顯帶預(yù)處理可除去陰性G帶區(qū)的疏水蛋白,，或使它們的結(jié)構(gòu)變成更疏水狀態(tài),。由此可知，在G顯
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06 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選

1．確定抗生素作用的*濃度：不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性,，因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn),，確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的zui低作用濃度。①提前24小時(shí)在96孔板或24孔板中接種細(xì)胞8孔,，接種量以第二天長(zhǎng)成25%單層為宜,，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。②將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基,，抗生素濃度按梯度遞增0,（50,100,200,400,600,800和1000μg/ml）,。③培養(yǎng)10-14天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為400-800μg/ml,，篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別維持時(shí)使
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06 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：乙醇沉淀DNA實(shí)驗(yàn)操作方法

1.加入1/10體積的乙酸鈉（3mol/L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混勻,，使其zui終濃度為0.3mol/L,；2.加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃中15~30分鐘；3.12,000g離心10分鐘,，小心移出上清液,，吸去管壁上所有的液滴；4.加入1/2離心管容量的70％乙醇,，12000g離心2分鐘,，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴,；5.于室溫下將開(kāi)蓋的EP管的置于實(shí)驗(yàn)桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干,；6.加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。
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06 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：目的基因的亞克隆

實(shí)驗(yàn)題目：目的基因的亞克隆一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,、掌握細(xì)菌基因組提取的方法和原理。2,、掌握限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組及其結(jié)果分析,。3、掌握基因片段回收的方法,。二,、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌基因組的提取：通過(guò)堿法或者酶法裂解細(xì)菌之后,，可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來(lái),。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于0.14mol/L的NaCl,，而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中,，通過(guò)溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開(kāi)。氯仿－異戊醇法除去蛋白,，2倍體積乙醇將DNA沉淀出來(lái),。限制性核
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06 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：基因克隆：感受態(tài)細(xì)胞制作

方法一A液：1M,，MnCl2：B液：1M,，HEPES，pH=6.2-6.8,，用無(wú)菌水配,，配后不需滅菌；C液稱(chēng)取CaCl20.10g，KCl1.18g,，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶,，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解,。將瓶塞蓋上并用牛皮紙,、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用,。取1管B液（0.6ml）,，全部加入C液（46ml）中，混勻后,，再用1ml移液器加入3.3mlA液,，混勻冰浴即可使用。劃線得到單菌落,，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時(shí),，挑取2-4個(gè)形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100mlS
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06 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用,。質(zhì)粒的分離與提取是Z常用,、Z基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

測(cè)定DNA的核苷酸序列是分析基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提,。從小片段重疊法到加減法,、雙脫氧鏈終止法,、化學(xué)降解法,、自動(dòng)測(cè)序，DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展很快,。目前在實(shí)驗(yàn)室手工測(cè)序常用Sanger雙脫氧鏈終止法,。Sanger法就是使用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一種單鏈的DNA模板或經(jīng)變性的雙鏈DNA模板和一種恰當(dāng)?shù)腄NA合成引物,。其基本原理是DNA聚合酶利用單鏈的DNA模板,，合成出準(zhǔn)確互補(bǔ)鏈，在合成時(shí),，某種dNTP換成了ddNTP,，這時(shí)，DNA聚合酶利用2’,，3’-雙脫氧核苷
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06 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：質(zhì)粒的制備

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體,，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是zui常用,、zui基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù),。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解,、質(zhì)粒DNA的分離和純化,。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過(guò)程,。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理,、步驟及各試劑的作用。實(shí)驗(yàn)材料：含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液,，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液,。實(shí)驗(yàn)原理：在pH12.0~12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開(kāi)
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02 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：DNA的酶切與連接

標(biāo)簽：DNA重組限制性內(nèi)切酶酶切連接連接酶利用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一,。成功的酶切和有效的連接為后續(xù)的外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)提供了有效的實(shí)驗(yàn)材料,。實(shí)驗(yàn)方法質(zhì)粒DNA酶切DNA段連接實(shí)驗(yàn)方法原理限制性內(nèi)切酶能夠特異性地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA,。實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)準(zhǔn)pUC19（2686bp）試劑,、試劑盒EcoRI及其配套的酶切緩沖液0.5×TBE電泳緩沖液6×LoadingBu
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