聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年您現(xiàn)在的位置： 首頁(yè)> 公司動(dòng)態(tài)> DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
1．確定抗生素作用的*濃度： 不同的細(xì)胞株對(duì)各種抗生素有不同的敏感性,，因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn),，確定抗生素對(duì)所選擇細(xì)胞的zui低作用濃度,。
① 提前 24 小時(shí)在 96 孔板或 24 孔板中接種細(xì)胞 8 孔，接種量以第二天長(zhǎng)成 25%單層為宜,，置 CO2 孵箱中 37℃培養(yǎng)。
② 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基， 抗生素濃度按梯度遞增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml）,。
③ 培養(yǎng) 10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),一般為 400-800μg/ml，篩選穩(wěn) 定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級(jí)別維持時(shí)使用篩選濃度的一半,。
2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行,。
3．轉(zhuǎn)染 72 小時(shí)后按 1: 10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在 6 孔板中傳代，換為含預(yù)試驗(yàn)中 確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基,。在6 孔板內(nèi)可見單個(gè)細(xì)胞,，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個(gè) 細(xì)胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落，此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆,。
① 濾紙片法：用消毒的 5x5mm 濾紙片浸過胰酶,，將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上 10-15 秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于 24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng),。 細(xì)胞在 24 孔板中長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)入 25cm2 培養(yǎng)瓶中,，長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)入 75cm2 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
② 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的 10 倍稀釋（10-2-10-10） ,，將每 一稀釋度的細(xì)胞滴加到 96 孔板中培養(yǎng),，7- 10 天后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔再一次進(jìn)行克隆,。
4. ELISA或 Westernblot檢測(cè)單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的 表達(dá)水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量zui高的克隆傳代并保種,。
