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質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是zui常用,、zui基本的實驗技術(shù),。
質(zhì)粒的提取方法很多,，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解,、質(zhì)粒DNA的分離和純化,。本實驗以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程,。
實驗?zāi)康模?/strong>掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理,、步驟及各試劑的作用。
實驗材料：含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液,，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液,。
實驗原理：在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開,，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài),。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA,、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀,，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心,，可除去大部分細胞碎片,、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì),，質(zhì)粒DNA尚在上清中,，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA,。
實驗步驟：
1.取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37℃過培養(yǎng),；
2.用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中,，37℃搖床~250 r/min過培養(yǎng),；
3.吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘,，收集菌體,，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液,，再次收集菌體,，盡量將菌液倒干凈；
4.加入300 ml溶液 I振蕩打勻,，重新懸浮細胞,，震蕩混勻（注意：應(yīng)*打勻沉淀或碎塊）；
5.加入300 ml溶液II,，輕柔顛倒混勻,，放置至清亮,，一般不超過5分鐘；
6.加入300 ml溶液III顛倒混勻,，放置于冰上10分鐘,，使雜質(zhì)充分沉淀；
7.12000 g離心10分鐘,；
8.吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中,，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘,；
9.12000 g 常溫離心15分鐘,；
10.倒盡上清，加75%乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）,；
11.室溫放置或超凈臺上風(fēng)干DNA,；
12.加40 ml滅菌超純水或TE溶解；
13.質(zhì)粒,、BAC的質(zhì)量檢測,，于-20℃保存。
附注：質(zhì)粒檢測
電泳檢測：質(zhì)粒電泳一般有三條帶,，分別為質(zhì)粒的超螺旋,、開環(huán)、線型三種構(gòu)型
吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm,、280nm波長吸光值,，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好,，1.8為*,，低于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說明有RNA污染,。
