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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體,，它在基因操作中具有重要作用,。質(zhì)粒的分離與提取是Z常用,、Z基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
2013-8-6 閱讀(1628)
測(cè)定DNA 的核苷酸序列是分析基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提,。從小片段重疊法到加減法,、雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法,、自動(dòng)測(cè)序,，DNA 測(cè)序技術(shù)發(fā)展很快。目前在實(shí)驗(yàn)室手工測(cè)序常用Sanger雙脫氧鏈終止法,。Sanger法就是使用DNA 聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA 核苷酸序列的方法,。它要求使用一種單鏈的DNA 模板或經(jīng)變性的雙鏈DNA 模板和一種恰當(dāng)?shù)腄NA 合成引物。其基本原理是DNA 聚合酶利用單鏈的DNA 模板,，合成出準(zhǔn)確互補(bǔ)鏈,，在合成時(shí)，某種dNTP換成了ddNTP,，這時(shí),，DNA 聚合酶利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物,，使之摻入到寡核苷酸鏈的3’末端,，導(dǎo)致3’末端無(wú)3'-OH，從而終止DNA 鏈的生長(zhǎng)，雙脫氧核苷酸的種類不同,，摻入的位置不同就造成了在不同的專一位置終止的長(zhǎng)度不同的互補(bǔ)鏈,。通過(guò)摻入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可讀出模板DNA 的互補(bǔ)鏈序列,。
一,、 試劑準(zhǔn)備
1. 硅化液：250ml，二氯二甲基硅烷25ml,。
2.6%變性PAGE膠的配制：丙烯酰胺 28.5g,，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺1.5g,，10×TBE 50ml,，尿素210g，加ddH2O至500ml攪拌溶解,，0.22μm濾膜過(guò)濾,，4℃貯存于棕色瓶中。使用時(shí)取50ml加入催化劑過(guò)硫酸銨（25%）50μl,，TEMED 50μl,，輕搖混勻，立即灌膠,。
3.質(zhì)粒DNA 堿變性液：NaOH 2M,，NaAc 3M（pH4.8），無(wú)水乙醇,，70%乙醇,。
4.T7測(cè)序試劑盒。
二,、操作步驟
1. 測(cè)序板硅化,，流水、ddH2O洗,，無(wú)水乙醇洗,，晾干。
2. 灌膠：裝好測(cè)序板,，玻璃板以15-30°角度傾斜放置,，用50ml注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間，將鯊魚(yú)齒梳子的平端插入膠的上緣,，深約0.5-1cm,。夾好,，將測(cè)序板放水平,。聚合約3hr后預(yù)電泳,。
3. 預(yù)電泳：按照說(shuō)明要求安裝好電泳裝置，在上槽和下槽注入1×TBE,。設(shè)置溫度50℃,，功率100W，時(shí)間約30min,。
（同時(shí)準(zhǔn)備測(cè)序反應(yīng)）
4. 質(zhì)粒DNA 雙鏈堿變性：DNA 3-5μg溶于32μl ddH2O中,，加2N NaOH 8μl，混勻,，室溫靜置15min,。加3M NaAc 7μl，無(wú)水乙醇120μl,，混勻,，-20℃放置30min。離心12000g× 15min,，棄上清,，70%乙醇500μl洗一次，離心12000g×7min,。棄上清,，晾干沉淀，10μl滅菌ddH2O溶解,。
5. 模板與引物復(fù)性：加2μl測(cè)序引物,、2μl Annealing buffer， 混勻,，稍稍離心,，65℃溫育 5min,，立即放置于37℃10min,，室溫5min以上。
6. 標(biāo)記反應(yīng)：加 3μl labeling mixture ,、1μl相應(yīng)放射性同位素（10μCi）,、2μl T7測(cè)序酶（使用前以稀釋液1∶5稀釋），混勻,，離心，置37℃5min,。
7. 預(yù)先準(zhǔn)備四個(gè)0.5ml微量離心管,，標(biāo)上A、C,、G,、T，分別在其中加入2.5μl的ddATP,、ddCTP,、ddGTP,、ddTTP,。
8. 鏈終止反應(yīng)：在A,、C,、G、T四個(gè)微量離心管中分別加入反應(yīng)液4.5μl,，37℃ 5min,。加入stop solution 5μl,，短暫離心,。
9. 上樣：關(guān)上預(yù)電泳電源，沖洗膠平面,，將鯊魚(yú)齒插入膠平面中約1-2mm形成加樣孔。將四個(gè)反應(yīng)管置80℃ 2min,。立即取1.5-2μl加到加樣孔上,。
10．電泳: 50℃，100W,，電泳2.5hr后,，暫停電泳，在預(yù)留孔二次上樣后,，繼續(xù)電泳2.5hr,。
11．下膠：停止電泳，取下測(cè)序板,，倒掉電泳緩沖液,。拆開(kāi)測(cè)序板，凝膠應(yīng)粘在未硅化的的玻璃板上,。裁一張比膠稍大一些的濾紙,，平鋪在膠上，掀起濾紙,，凝膠就被一起掀起,。
12．壓片：將凝膠蓋上保鮮膜，用monitor測(cè)讀放射強(qiáng)度,，以估計(jì)曝光時(shí)間,。在暗室中覆上X光片,，置暗夾中，-70℃放射自顯影,。
13．洗片,、讀片：取出暗夾，回到室溫,。經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影,，水洗,，晾干。在X光片燈上讀出序列,。
三,、注意事項(xiàng)
1. 測(cè)序板清洗、硅化的好壞直接影響灌膠及下膠,。處理不好時(shí)容易導(dǎo)致灌膠時(shí)氣泡的產(chǎn)生,，下膠時(shí)則易使電泳膠損壞。
2. 灌膠時(shí)要避免膠的滲漏,；注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間時(shí),，注意速度的控制，防止氣泡的產(chǎn)生,。
3. 測(cè)序反應(yīng)及電泳上樣時(shí)要注意小心操作,，防止放射性同位素污染，同時(shí)要加強(qiáng)整個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自身的防護(hù),。
4. 規(guī)范,、妥善處理放射性同位素接觸物品及廢棄物。
手工測(cè)序需要使用同位素,，這給操作帶來(lái)許多不便,，對(duì)操作者也有一定的損害。DNA 測(cè)序儀的出現(xiàn)解決了這一問(wèn)題,，它不使用同位素標(biāo)記,，自動(dòng)化程度高,，測(cè)序效果好,。雖然DNA 測(cè)序儀的價(jià)格目前仍比較高，但每次測(cè)序的花費(fèi)并不算高,，而且商品化服務(wù)也令人滿意,。
