日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

方法一

A液：1M,，MnCl₂：

B液：1M，HEPES,，pH=6.2-6.8,，用無(wú)菌水配,，配后不需滅菌；

C液 稱(chēng)取CaCl2 0.10g,，KCl 1.18g,，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水,，輕輕振蕩使所有組分充分溶解,。將瓶塞蓋上并用牛皮紙,、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用,。

取1管B液（0.6ml）,，全部加入C液（46ml）中，混勻后,，再用1ml移液器加入3.3ml A液,，混勻冰浴即可使用。

劃線得到單菌落,，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時(shí),， 挑取2-4個(gè)形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養(yǎng)基的三角瓶,，37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養(yǎng)3-4小時(shí),，將培養(yǎng)溫度調(diào)至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養(yǎng),，其余與普通感受態(tài)差不多，每管加入4ml TB緩沖液,，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮,，加入280ml DMSO（可用國(guó)產(chǎn)分析純）,，混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘,。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍,，在液氮中靜置12小時(shí)以上,。取出感受態(tài)放入-70℃超低溫冰箱備用,。

效率非常高,，一般可到10*8,，好時(shí)可到10*9,，特別適宜于大片段與文庫(kù)構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化。

潔凈是zui重要的,。無(wú)菌都無(wú)所謂,，在操作臺(tái)上可正常操作。離心力要注意不要超過(guò)2500g,，建議1500-2000g 5min。涂板要注意,，不要覺(jué)得不勻而多次反復(fù),，輕輕在平板上帶一下感覺(jué)板上大部分地方走過(guò)即可,，特別在冰箱中保存過(guò)或在溫箱中溫浴2小時(shí)以上的板,。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會(huì)減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。

預(yù)冷是必要的,。整個(gè)過(guò)程的低溫也并非特別重要,，只要注意就行了,，我在去殘液時(shí)經(jīng)常在室溫倒置1min，對(duì)感受態(tài)效率提高有幫助,，*次多加一點(diǎn)緩沖液,，我經(jīng)常加至20ml，效果不錯(cuò),。

關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，zui復(fù)雜的莫過(guò)于電轉(zhuǎn)化,，而zui簡(jiǎn)單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開(kāi)始轉(zhuǎn)化,。對(duì)于做克隆工作的人而言,，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。

現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率zui高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化,，可達(dá)到1010,，但是操作起來(lái)比較麻煩。要想又簡(jiǎn)單,，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率,，的莫過(guò)于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法,。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況,，我們將其稍作修改，做成了GLP文件,，但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方,，其中有一些對(duì)普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助,。

1、所用器具的潔凈程度,。這一點(diǎn)非常重要,，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的，毋庸置疑,。

2,、培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的,，這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的能量代謝問(wèn)題，是有氧還是無(wú)氧生長(zhǎng),。厭氧生長(zhǎng)出來(lái)的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的,。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml,。

3,、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值,，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值,。一般來(lái)說(shuō)，接種前的pH值在6.8-7.2,，等菌搖好后,，可以測(cè)一下pH值，不要低于6.0,，在6.5以上,。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長(zhǎng)狀態(tài)良好,，按要求做,，肯定效率不低。

4,、培養(yǎng)后的OD值,。其實(shí)這并一個(gè)非常重要的參數(shù)，只是當(dāng)OD值大到一定的程度后,，菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能,，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6，0.8等等,。同時(shí),，OD值大時(shí)菌體總量大，因而感受態(tài)數(shù)量要大一點(diǎn),，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn),。

5、培養(yǎng)基中的各種離子,。經(jīng)驗(yàn)證明,，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2 離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高,。在制備普通感受時(shí),，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入,，會(huì)收到很好的效果,。

6,、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們,，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成,，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用,，因而產(chǎn)生了Inoue的感受態(tài)制備方法,，它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。

7,、此外文獻(xiàn)報(bào)道,，在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比的效果要好,，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加,。

8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高,，因此推薦用液氮速凍感受態(tài),，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時(shí)以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱,，這點(diǎn)未做實(shí)驗(yàn)，只是一種感覺(jué),，*次這樣做了,，沒(méi)問(wèn)題，以后就照此辦理而已,。

方法二

1.液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5,，JM109，HB101等,，在LB平板上劃線,，37度至長(zhǎng)出單菌落。

2.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個(gè),，接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基量不可再多,，會(huì)影響效率。

3.在18度150-250RPM 培養(yǎng)19-50小時(shí)*沒(méi)有冷卻搖床的可在室溫,，但不可高于37度,。

4.OD600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng)，放在冰水中冷卻10分鐘,。

5. 4度,，300RPM離心15分鐘，回收菌體,。

6.去掉上清后,，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮,，在冷10分鐘。

7.再次離心回收菌體,。

8.用1/12.5體積的TB懸浮,，添加zui終濃度為7%的DMSO，再冷卻10分鐘,。

9.0.1 -1毫升分裝,，直接在液氮中凍上。

10.在液氮或-80度保存,。

【zihudie 】

（1）將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上,，37℃培養(yǎng)活化。

（2）挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基,，18℃,，200-250rpm培養(yǎng)。

（3）當(dāng)OD600=0.5-0.8時(shí),，用預(yù)冷的40mL離心管于4℃,，8000rpm離心10min，收集菌體,。

（4）用預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體,，4℃，8000rpm離心10min,，收集菌體,。

（5）重復(fù)第4步操作。

（6）用8mL預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體,，緩慢加入DMSO至終濃度7% ,。

（7）冰浴10min后，分裝保存于液氮中,。

本法效率*,，建議大家采納

【yog】

1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM-----1%轉(zhuǎn)接-------37度 200RPM2小時(shí)（OD到0.4~0.5）

2. 2ml，冰浴15min,，4度,，6000RPM 5min，棄上清,，懸浮于1ml0.1MCaCl2 中,，冰浴20min

3. 4度，6000RPM 10min,，重懸浮于200μl0.1MCaCl₂中,，冰浴30min

建議用TSS法，簡(jiǎn)單方便，比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高.別的菌可能不一定適用,。

以下為轉(zhuǎn)貼,，具體方法請(qǐng)查閱文獻(xiàn)。

E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法:

單菌落平板至2ml LB,，37℃ 250 r/m,，1ml 轉(zhuǎn)至50 ml LB，37℃ 250 r/m至 A600=0.2-0.4

離心后用10毫升TSS重懸后,，分裝 -70℃保存,。盡量冰上操作.

轉(zhuǎn)化: 加質(zhì)粒（<5 ul/100μlcell） 后冰上30分鐘，42℃ 90秒,，冰上2分鐘,，加LB至1ml，37℃ 1小時(shí)后鋪抗生素平板,。

TSS:

7.0ml pH6.1 LB

2.0ml 50% PEG6000

0.5ML dmso

0.2ML Mg₂ （0.1ml 1mol/l MgCl₂ and 0.1ml 1mol/l MgSO₄）

0.3ml ddH₂O