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實(shí)驗(yàn)題目 ：目的基因的亞克隆
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
1,、掌握細(xì)菌基因組提取的方法和原理,。
2、掌握限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組及其結(jié)果分析,。
3,、掌握基因片段回收的方法。
二,、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌基因組的提?。和ㄟ^堿法或者酶法裂解細(xì)菌之后，可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來,。DNA溶于1mol/L的NaCl中,，不溶于0.14mol/L的NaCl，而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中,，通過溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開,。氯仿－異戊醇法除去蛋白，2倍體積乙醇將DNA沉淀出來,。
限制性核酸內(nèi)切酶只作用于特定的位點(diǎn),，處理基因組后只會(huì)得到有限的片斷。通過單酶切或者多酶切后電泳檢驗(yàn)就可以得到與物種本身有關(guān)的特定的圖譜,。
電泳后選定目的基因的條帶,，紫外燈下將含有目的基因的凝膠切下，使用凝膠回收試劑盒,，將凝膠溶化后,，通過吸附柱時(shí)，核酸片段就吸附在柱上，洗脫液洗脫后加入2倍體積乙醇,，核酸沉淀,，TE溶解沉淀，核酸片段得到回收,。
三,、試劑與器材
1、試劑 E.coli JM109,，牛肉膏,，胰蛋白胨，NaCl,，微量細(xì)菌基因組抽提試劑盒（上海生工）,，BamH I、Xho1 核酸內(nèi)切酶（Takara）,，NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段（1kb DNA Ladder）,，凝膠電泳回收試劑盒
2、器材 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),，水平電泳儀,，漩渦混合儀，紫外檢測儀,，凝膠成像分析系統(tǒng),，微量移液器及吸頭。
四,、操作方法
1．使用LB培養(yǎng)基活化,、培養(yǎng)菌體。
2．離心收集菌體,，根據(jù)試劑盒說明提取基因組,。
3．限制性酶處理基因組。
4．E.coli JM109的基因組經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理后,，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測,，凝膠成像系統(tǒng)將酶切圖譜采集下來并對(duì)其分析。
5．紫外燈下將需要回收的核酸片段切下來,，使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段,。
6．電泳檢測回收的核酸片段。
五,、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)
1．菌體培養(yǎng)過程要嚴(yán)格無菌,，染菌后提取得到的基因組會(huì)成多條帶，酶切的圖譜也會(huì)比較復(fù)雜,。
2．基因組提取過程中所使用的器材要嚴(yán)格滅菌,，防止核酸酶降解基因組,。
3．基因組提取過程不可以劇烈振蕩，防止DNA斷鏈,。
4．在內(nèi)切酶zui適條件下充分處理基因組,，得到正確的圖譜。
5．瓊脂糖溶化要充分,。
6．切下凝膠時(shí)要注意防護(hù)紫外線,，電泳結(jié)束之后盡快將膠條切下來，凝膠條要窄,，脫尾部分不回收,。
六、思考題
1．BamH I,、Xho1的作用位點(diǎn)分別是什么,？
2．內(nèi)切酶分析基因圖譜的注意事項(xiàng)？
3．瓊脂糖溶解不好會(huì)對(duì)核酸片段回收產(chǎn)生什么影響,？
4．凝膠回收的注意事項(xiàng),？
