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一,、概念當前,，所謂蛋白質(zhì)測序,，主要指的是蛋白質(zhì)的一級結構的測定,。蛋白質(zhì)的一級結構（Primarystructure）包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目,。很多場合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用,。多肽鏈的氨基酸順序,，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎,。蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎,。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬個不同蛋白質(zhì)的一級結構,。二,、測定步驟1多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子,，必須先進行拆分,。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì),，如,，血
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免疫球蛋白（ImmunoglobulinIg）的含量代表著機體體液免疫的水平，并進一步代表著B細胞的功能,，因此測定血清Ig含量可以推知機體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低,。隨著免疫學的發(fā)展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為*的手段,。純化的方法很多,，有單一法，但大多數(shù)采用二步法以上相結合的方法,，特別是以硫酸銨提純?yōu)榛A,，再經(jīng)過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度zui為常用。硫酸銨溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來（稱為鹽析）,。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋
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蛋白質(zhì)技術專題：蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗
[原理]蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下,，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開,，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復合物,，該復合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移,，且主要由于凝膠的分子篩作用,，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽,。聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng),，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液,，其pH值和離子強度也相應不同,，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復合物沿移動的界面移 -
不同大小的蛋白質(zhì)分子進入膠體過濾管柱,，可依其分子量差異分離,；是一種廣泛應用的partition色析法（Pharmacia操作手冊，GelFiltration）,。儀器設備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）,、鐵架、鐵夾及水平儀,；部分收集器（fractioncollector,需準備干凈試管約100支）,；濃縮用離心機（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請注意其使用方法藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Phar
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反相色譜（reversedphascchromatography,RPC）是基于溶質(zhì),、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應建立的一種色譜模式,，任何一種有機分子的結構中都有非極性的疏水部分，這部分越大,，一般保留值越高,，在液相色譜中這是應用面zui廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下,，流動相多采用酸性的,、低離子強度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇,、乙腈或甲醇等有機改性劑,，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外,，也有少量高聚物微球,。實驗表明，烷基鏈長對
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蛋白質(zhì)技術專題：蛋白標準品（Marker）知識匯總
相關專題蛋白Marker可分為：一、未預染的Marker即寬分子量蛋白標準,、高分子量蛋白標準以及低分子量蛋白標準;二,、預染的Marker即單色預染和多色預染。在westernblot過程中,，分子量Marker就像個螺絲釘一樣沒雖然是個小細節(jié),，然而就是這樣一個小細節(jié)對實驗結果有著不可忽視的作用。這個WesternBlot參照家族的一員的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小,，只有標準量無誤了,，實驗結果才有說服力，除此之外,，蛋白標準還有表示轉(zhuǎn)移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用,，所以選擇 -
重組DNA技術是現(xiàn)代分子生物技術發(fā)展中zui重要的成就之一。即是基因工程（GeneEngineering）的核心技術,。重組DNA技術（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA段）在體外與基因運載體重組,，轉(zhuǎn)移至另一細胞或生物體內(nèi)，以達到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的,。這一技術的發(fā)展和應用,，關鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應用。一,、限制酶限制性內(nèi)切核酸酶（restrictiveendonucleases）,，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶
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蛋白質(zhì)技術專題：凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)
（一）原理凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類,，這類將影響以后的純化,，所以純化前均應除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）,。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法,，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點是透析后析品終體積較小,，但所需時間較長,，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡,，所需時間也短,，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以,，要根據(jù)具體情況選擇使用,。前實驗中樣品體積較小，凝膠達濾后樣品體積不會太增加,，所以選用凝膠過濾法,。（二）試劑與器材（1）SephadexG-25,。（2）0.
