DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞說明書

（Rev.A）

保 存：-80℃保存，運(yùn)輸為干冰包裝,。自收貨之日起液氮保存至少一年,，-80℃保存至少 6 個(gè)月。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

大腸桿菌DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞是經(jīng)特殊工藝制備的,，適用于昆蟲桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)中同源重組的菌株,，用于產(chǎn)生重組Bacmid。使用pFastbacHTA質(zhì)粒檢測(cè),，轉(zhuǎn)化效率zui高可達(dá)2×10⁷CFU/ug,，-80°C 保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara,leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124

產(chǎn)品特點(diǎn)：
DH10Bac 細(xì)胞包含親本 Bacmid bMON14272 和輔助質(zhì)粒 pMON7124,。親本 Bacmid 包含一個(gè) mini-F 復(fù)制子,、卡那霉素抗性基因,、 Tn7 位點(diǎn)和 lac Z α-互補(bǔ)因子,。att輔助質(zhì)粒包含 tns ABCD 區(qū)域，該區(qū)域提供了 mini-Tn7從供體質(zhì)粒插入親本 Bacmid 靶位點(diǎn)所需要的轉(zhuǎn)座蛋白,。供體如 pFastBac 系列質(zhì)粒（pFastBac1,，pFastBac Dual等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重組臂,，Tn7R 和 Tn7L 之間包含慶大霉素抗性基因、昆蟲病毒多角體基因啟動(dòng)子,、多克隆位點(diǎn)和 SV40 病毒的 PolyA 加尾信號(hào),。當(dāng)含有靶基因pFastBac 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH10Bac 細(xì)胞后，發(fā)生重組后就可產(chǎn)生重組 Bacmid,，提取純化重組 Bacmid 轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 Sf9 或 Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲病毒,。

此外，DH10Bac 細(xì)胞中的 The φ80dlacZDM15 基因的產(chǎn)物可以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)現(xiàn)象,，用于重組bacmid 的藍(lán)白斑篩選,。

操作步驟（以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）：
制備含下面抗生素的 LB 固體平板：50 μg/ml kanamycin、7 μg/ml gentamicin,、10 μg/ml tetracycline,、100 μg/ml X-gal、40 μg/ml IPTG,。
1.  取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中,，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中,。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100 μl ,，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用 DNA 體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一,。以下實(shí)驗(yàn)以 100 μl 感受態(tài)細(xì)胞為例,。
2.  向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入 1-10 ng 重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物,，在冰浴中靜置 30 分鐘,。
3.  將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置 90 秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,，使細(xì)胞冷卻 2 分鐘,，該過程不要搖動(dòng)離心管。
4.  向每個(gè)離心管中加入 900 μl 無菌的 SOC（不含抗生素）,，混勻后置于 37 ℃ 200 rpm,，搖床振蕩培養(yǎng) 4 小時(shí)。
5.  用 SOC 培養(yǎng)基進(jìn)行 10 倍梯度稀釋,，如分成 3 個(gè)稀釋梯度 10^-1, 10^-2, 10^-3
6.  取 100 μl 的各個(gè)梯度的培養(yǎng)物用于涂布,。等平板中的液體*吸收后，倒置平板,，37℃培養(yǎng) 24-48 小時(shí),。
7.  保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，視平板上菌落生長(zhǎng)情況決定去留,。

相關(guān)試劑及培養(yǎng)基的制備方法:
1. SOB 和 SOC 培養(yǎng)基：稱取 20g 胰蛋白胨 ,，5g 酵母粉 ,，0.5g NaCl置于 1L 燒杯中加入約 800ml 的去離子水，*溶解后再補(bǔ)加 10ml 250 mM KCl 溶液,，滴加 5M NaOH（約 0.2ml）調(diào) pH 值 7.0,。 加入去離子水將培養(yǎng)基定容至 1L。121℃高溫高壓滅菌15min,。使用時(shí)加入 5ml 滅菌的 2M MgCl₂ 溶液（此種培養(yǎng)基稱為SOB）,。再補(bǔ)加經(jīng) 0.22 μm 過濾除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml（此種培養(yǎng)基為 SOC）。
2. 轉(zhuǎn)化復(fù)蘇細(xì)菌用的液體 SOC 培養(yǎng)基：可以一次高壓 50ml 液體培養(yǎng)基,，無菌狀態(tài)按 1ml 每管分裝于高壓滅菌的 1.5ml 離心管中,，裝于自封袋中，凍存于-20℃中,，每次用一支,。可以*地避免培養(yǎng)基污染和減少勞動(dòng)量,。
3. LB 固體選擇培養(yǎng)基：100ml LB 液體培養(yǎng)基中加入 1.5 g 瓊脂粉,，搖勻后，121℃高壓滅菌 20 分鐘,。冷卻至 50℃左右時(shí)加入相應(yīng)濃度的抗生素（如 氨芐青霉素,，濃度通常為 100μg/ml），混勻后倒在細(xì)菌用的無菌培養(yǎng)皿中,，等瓊脂凝固后即可使用,。
4. IPTG：稱量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40 ml 滅菌水，濃度為 200mmol/L,。用無菌 0.22 μm過濾膜過濾除菌,。小份分裝后，-20℃保存,。
5. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20 mg/ml,，小份分裝（1 ml/份）后，-20℃避光保存,。

注意事項(xiàng)：

1. 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-80℃,，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低,。
2. 實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作,，防止其它 DNA 或雜菌的污染，避免為以后的篩選,、鑒定帶來影響,。
3. 轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源 DNA 量過多或體積過大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率,。轉(zhuǎn)化時(shí) DNA 體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一,。
4. 轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板 DNA 總量,。
5. 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功,，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化,，將損失降到zui低,。

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