免疫組化技術(shù)服務(wù)

工作原理：辣根過氧化物酶（HRP）的分子量（40000）,，它不會(huì)遮蓋抗原的結(jié)合部位，具有較高活性及特異性,，可溶性佳,，生成的產(chǎn)物不擴(kuò)散，可作用于多種底物,，產(chǎn)生不同顏色且HRP穿透力強(qiáng),，易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。DAB在 H2O2存在的情況下,，可以作為HRP的電子供體,，產(chǎn)生褐色的不溶顆粒，可作為顯色的試劑,。
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試劑內(nèi)容：
 名稱    規(guī)格
1,、0.01mol/L pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液  1L
2 、PBS緩沖液  2L
3,、 廣譜二抗  3mL
4 ,、30%H2O2  10 mL
5 、DAB顯色液I  0.6mL
6 ,、DAB顯色液II  0.6mL

自備試劑：無水乙醇,、蘇木素。
 

免疫組化技術(shù)服務(wù)

操作步驟：
1,、60℃常規(guī)脫蠟至水后,，將石蠟切片先后浸入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各10min,。然后逐級(jí)降濃度酒精入水,，每次3-5 min。
① * 3－5min
② 90% 酒精 3－5min
③ 85% 酒精 3－5min
④ 75% 酒精 3－5min
⑤ PBS洗滌3次 每次5 min
2,、熱修復(fù)抗原： 將切片置于0.01mol/L pH6.0枸櫞鈉緩沖液,，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10 min后,，反復(fù)1-2 次,，置于室溫自然冷卻。0.01 mol/L  pH7.0左右的PBS洗滌3次,，每次5 min
3,、消除內(nèi)源性過氧化物酶：用3% H 2 O 2 室溫孵育 5-10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,。PBS洗滌2-3次,，每次5 min,；
4、滴加一抗： 滴加適當(dāng)稀釋的一抗到切片上,，37℃孵育1小時(shí)左右或者4℃過一夜,， pH7.4的PBS洗滌3次，每次5 min ,。（一抗的稀釋度,、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系,。一般來說,，陽性染色強(qiáng)度不夠時(shí)，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時(shí)間,；背景過高時(shí),，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間。）
5,、加入廣譜二抗,，37℃孵育1小時(shí)，取出后PBS洗滌3次,，每次5 min,。
6,、DAB顯色： 取DAB顯色液I及II各50微升加至入1mL的水中,，配成DAB工作液，滴加到切片上,，室溫顯色,，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色,。蒸餾水充分洗滌以終止反應(yīng),。
7、觀察顯色后自來水沖,，蘇木精復(fù)染1-2min,，，自來水沖10min,，梯度酒精脫水,，二甲苯透明，中性樹膠封片,，干燥,，分析拍照