1. 原理

    免疫熒光技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理,，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞內(nèi)的相應抗原（或抗體）,。在細胞中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進入高能態(tài),，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的,，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài),，這時發(fā)出明亮的熒光,，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位,，以及利用定量技術測定含量,。免疫熒光技術分直接法、間接法和補體法,，zui常見的為間接法,。

    在同一細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時,，需進行雙重熒光染色，稱為免疫熒光雙標,。用未標記的兩種特異性*抗體孵育細胞,，洗去多余的*抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標記的第二抗體孵育細胞,，洗去多余的第二抗體,，后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發(fā)濾片觀察，從而對兩種抗原進行定位和定量,。使用此法應注意兩種特異性*抗體必須來源于不同種屬,，且熒光標記第二抗體的種屬必須與*抗體的種屬相匹配,。

2. 實驗步驟

（1）在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,，每次3 min；
（2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,， PBS浸洗玻片3次,，每次3 min；
（3）用0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）,；
（4）PBS浸洗玻片3次,，每次3 min；

（5）在玻片上滴加正常山羊血清,，室溫封閉30 min,；
（6）吸水紙吸掉封閉液，不洗,，同時滴加兩種一抗混合液并放入濕盒,，4℃孵育過夜；
（7）PBST浸洗爬片3次,，每次5 min,，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗混合液，濕盒中20－37℃孵育1 h,；

（8）PBST浸洗爬片3次,，每次5 min；

（9）滴加DAPI避光孵育5 min,，對標本進行復染核,，PBST、5 min×4次洗去多余的DAPI,；（10）用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片；

（11）在熒光顯微鏡下觀察,。

3. 注意事項

（1）兩種一抗要來源于兩種不同的動物,；

（2）二抗用兩種不同熒光信號標記,，且各自信號相互不干擾或干擾性小,；

（3）熒光染色后一般在1 h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4 h，時間過長,，會使熒光減弱,；
（4）每次試驗時，需設置以下三種對照：

     陽性對照：陽性血清+熒光標記物
     陰性對照：陰性血清+熒光標記物
     熒光標記物對照：PBS+熒光標記物,；

（5）抗體濃度和孵育時間需要事先摸索,。

注意事項： 

1.新鮮組織固定于4%多聚甲醛24h以上,； 

2.取材切面要平整，厚度不宜超過2mm,； 

3.請明確拍照部位及拍照倍數(shù)(一般為40X,、100X、200X,、400X),。