DH10Bac 感受態(tài)細胞說明書

（Rev.A）

保 存：-80℃保存,，運輸為干冰包裝。自收貨之日起液氮保存至少一年,，-80℃保存至少 6 個月,。

產(chǎn)品簡介：

大腸桿菌DH10 Bac感受態(tài)細胞是經(jīng)特殊工藝制備的，適用于昆蟲桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)中同源重組的菌株,，用于產(chǎn)生重組Bacmid,。使用pFastbacHTA質粒檢測，轉化效率zui高可達2×10⁷CFU/ug,，-80°C 保存幾個月轉化效率不發(fā)生改變,。

基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara,leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124

產(chǎn)品特點：
DH10Bac 細胞包含親本 Bacmid bMON14272 和輔助質粒 pMON7124。親本 Bacmid 包含一個 mini-F 復制子,、卡那霉素抗性基因,、 Tn7 位點和 lac Z α-互補因子。att輔助質粒包含 tns ABCD 區(qū)域,，該區(qū)域提供了 mini-Tn7從供體質粒插入親本 Bacmid 靶位點所需要的轉座蛋白,。供體如 pFastBac 系列質粒（pFastBac1，pFastBac Dual等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重組臂,，Tn7R 和 Tn7L 之間包含慶大霉素抗性基因,、昆蟲病毒多角體基因啟動子、多克隆位點和 SV40 病毒的 PolyA 加尾信號,。當含有靶基因pFastBac 的重組質粒轉化到 DH10Bac 細胞后,，發(fā)生重組后就可產(chǎn)生重組 Bacmid，提取純化重組 Bacmid 轉染昆蟲細胞 Sf9 或 Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲病毒,。

此外，DH10Bac 細胞中的 The φ80dlacZDM15 基因的產(chǎn)物可以實現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補現(xiàn)象,，用于重組bacmid 的藍白斑篩選,。

操作步驟（以下操作均按無菌條件的標準進行）：
制備含下面抗生素的 LB 固體平板：50 μg/ml kanamycin、7 μg/ml gentamicin,、10 μg/ml tetracycline,、100 μg/ml X-gal,、40 μg/ml IPTG。
1.  取感受態(tài)細胞置于冰浴中,，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中,，置于冰浴中。一次轉化感受態(tài)細胞的建議用量為 50-100 μl ,，可以根據(jù)實際情況分裝使用,。應注意所用 DNA 體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。以下實驗以 100 μl 感受態(tài)細胞為例,。
2.  向感受態(tài)細胞懸液中加入 1-10 ng 重組質粒,，輕輕旋轉離心管以混勻內容物，在冰浴中靜置 30 分鐘,。
3.  將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置 90 秒,，然后快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻 2 分鐘,，該過程不要搖動離心管,。
4.  向每個離心管中加入 900 μl 無菌的 SOC（不含抗生素），混勻后置于 37 ℃ 200 rpm,，搖床振蕩培養(yǎng) 4 小時,。
5.  用 SOC 培養(yǎng)基進行 10 倍梯度稀釋，如分成 3 個稀釋梯度 10^-1, 10^-2, 10^-3
6.  取 100 μl 的各個梯度的培養(yǎng)物用于涂布,。等平板中的液體*吸收后,，倒置平板，37℃培養(yǎng) 24-48 小時,。
7.  保留剩余的菌液于 4℃冰箱中,，視平板上菌落生長情況決定去留。

相關試劑及培養(yǎng)基的制備方法:
1. SOB 和 SOC 培養(yǎng)基：稱取 20g 胰蛋白胨 ,，5g 酵母粉 ,，0.5g NaCl置于 1L 燒杯中加入約 800ml 的去離子水，*溶解后再補加 10ml 250 mM KCl 溶液,，滴加 5M NaOH（約 0.2ml）調 pH 值 7.0,。 加入去離子水將培養(yǎng)基定容至 1L。121℃高溫高壓滅菌15min,。使用時加入 5ml 滅菌的 2M MgCl₂ 溶液（此種培養(yǎng)基稱為SOB）,。再補加經(jīng) 0.22 μm 過濾除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml（此種培養(yǎng)基為 SOC）。
2. 轉化復蘇細菌用的液體 SOC 培養(yǎng)基：可以一次高壓 50ml 液體培養(yǎng)基,，無菌狀態(tài)按 1ml 每管分裝于高壓滅菌的 1.5ml 離心管中,，裝于自封袋中，凍存于-20℃中,，每次用一支,?？梢?地避免培養(yǎng)基污染和減少勞動量。
3. LB 固體選擇培養(yǎng)基：100ml LB 液體培養(yǎng)基中加入 1.5 g 瓊脂粉,，搖勻后,，121℃高壓滅菌 20 分鐘。冷卻至 50℃左右時加入相應濃度的抗生素（如 氨芐青霉素,，濃度通常為 100μg/ml）,，混勻后倒在細菌用的無菌培養(yǎng)皿中，等瓊脂凝固后即可使用,。
4. IPTG：稱量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40 ml 滅菌水,，濃度為 200mmol/L。用無菌 0.22 μm過濾膜過濾除菌,。小份分裝后,，-20℃保存。
5. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20 mg/ml,，小份分裝（1 ml/份）后,，-20℃避光保存。

注意事項：

1. 感受態(tài)細胞應保存在-80℃,，不可反復凍融,，否則其轉化效率將會降低。
2. 實驗過程中應嚴格無菌操作,，防止其它 DNA 或雜菌的污染,，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響,。
3. 轉化時,，轉化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源 DNA 量過多或體積過大反而會降低轉化效率,。轉化時 DNA 體積要小于感受態(tài)細胞體積的十分之一,。
4. 轉化率的計算：轉化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板 DNA 總量。
5. 為防止轉化實驗不成功,，可以保留部分連接產(chǎn)物,，以重新轉化，將損失降到zui低,。

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