BCA 蛋白定量試劑盒：蛋白質(zhì)濃度測定的可靠方法

來源：上海易匯生物科技有限公司 2025年07月13日 11:06

在生命科學研究領(lǐng)域,，準確測定蛋白質(zhì)濃度是蛋白質(zhì)組學研究,、Western Blot酶活性分析等眾多實驗的基礎(chǔ),。BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白定量試劑盒作為一種經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的蛋白定量工具，憑借其基于雙縮脲反應(yīng)的原理和良好性能,，為科研人員提供了可靠的蛋白質(zhì)濃度測定方案,。

一、核心原理與試劑組成

（一）定量原理

BCA 蛋白定量試劑盒的原理基于雙縮脲反應(yīng)與 BCA 對銅離子的特異性顯色反應(yīng),。在堿性條件下,，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與二價銅離子（Cu2?）發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，使 Cu2?被蛋白質(zhì)中的肽鍵還原為一價銅離子（Cu?） ,。生成的 Cu?與 BCA 試劑結(jié)合,，形成紫色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在 562 nm 處有強烈的吸收峰,，且其吸光度值與蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。通過測定樣品溶液在 562 nm 處的吸光度,，并與已知濃度的蛋白質(zhì)標準品建立的標準曲線對比,，即可準確計算出待測樣品的蛋白質(zhì)濃度。

（二）試劑組成

A 液：主要成分是 BCA,，還包含碳酸鈉,、碳酸氫鈉、酒石酸鈉等緩沖物質(zhì),，以及氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH 值,，使溶液呈堿性環(huán)境，為雙縮脲反應(yīng)和 BCA 顯色反應(yīng)提供適宜條件 ,。其中,，酒石酸鈉能夠穩(wěn)定 Cu2?，防止其在堿性條件下形成沉淀,，保證反應(yīng)的順利進行,。

B 液：為硫酸銅溶液，提供反應(yīng)所需的 Cu2? ,。在使用時,，需將 A 液和 B 液按照 50:1 的比例混合，配制成 BCA 工作液,?；旌虾蟮墓ぷ饕褐校珺CA 與 Cu2?形成 BCA - Cu2?復合物,，該復合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)后生成紫色絡(luò)合物,，用于后續(xù)的吸光度測定。

蛋白質(zhì)標準品：通常為已知濃度的牛血清白蛋白（BSA）溶液,，作為定量的參照標準,。不同濃度的蛋白質(zhì)標準品用于繪制標準曲線,，常見的標準品濃度梯度包括 0 μg/mL、200 μg/mL,、400 μg/mL,、600 μg/mL、800 μg/mL,、1000 μg/mL 等,，科研人員可根據(jù)實際需求進行選擇和稀釋。

二,、產(chǎn)品性能優(yōu)勢

（一）高靈敏度與準確性

BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白質(zhì)具有較高的檢測靈敏度,，能夠檢測到低至 20 μg/mL 的蛋白質(zhì)濃度。其基于比色法的定量原理,，通過標準曲線建立蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關(guān)系,，結(jié)合精密的分光光度計檢測，可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)濃度的準確測定 ,。在實際應(yīng)用中,，該試劑盒的測量誤差較小，多次重復實驗結(jié)果的變異系數(shù)（CV）通?？刂圃?5% 以內(nèi),，能夠滿足科研實驗對蛋白質(zhì)濃度準確性的要求。

（二）良好的兼容性

該試劑盒與多種蛋白質(zhì)樣本類型兼容,，無論是細胞裂解液,、組織勻漿、血清,、血漿,，還是純化后的蛋白質(zhì)溶液，均可使用 BCA 法進行定量 ,。同時,，BCA 蛋白定量對去污劑具有一定耐受性，常見的 Triton X - 100,、SDS 等去污劑在較低濃度下（如 Triton X - 100≤0.1%,，SDS≤0.05%），不會對定量結(jié)果產(chǎn)生顯著影響,，方便科研人員對含有去污劑的蛋白質(zhì)樣本進行直接測定 ,。但需注意,，過高濃度的去污劑或某些強還原劑（如 DTT,、β - 巰基乙醇）可能會干擾反應(yīng)，需進行適當?shù)臉颖绢A處理或優(yōu)化實驗條件,。

（三）穩(wěn)定性與便捷性

BCA 試劑在儲存和使用過程中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。A 液和 B 液在常溫避光條件下可長期保存,，混合后的 BCA 工作液在室溫下數(shù)小時內(nèi)仍能保持穩(wěn)定的顯色性能,，可滿足常規(guī)實驗的使用需求。操作流程相對簡便,，只需將樣本,、標準品與 BCA 工作液混合，孵育一定時間（通常 37℃孵育 30 分鐘或室溫孵育 2 小時）后,，即可進行吸光度測定,，無需復雜的分離和純化步驟，適合大規(guī)模樣本的快速定量 ,。

（四）寬線性范圍

BCA 蛋白定量試劑盒具有較寬的線性范圍,，一般可在 20 - 2000 μg/mL 的蛋白質(zhì)濃度區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 ?？蒲腥藛T可根據(jù)樣本中蛋白質(zhì)濃度的預估范圍,，選擇合適的稀釋倍數(shù)，使樣本的吸光度值處于標準曲線的線性范圍內(nèi),，確保定量結(jié)果的準確性和可靠性 ,。對于蛋白質(zhì)濃度過高或過低的樣本，通過適當稀釋或濃縮處理,，也能實現(xiàn)準確的定量分析。

三,、實驗應(yīng)用與操作要點

（一）標準曲線繪制

稀釋蛋白質(zhì)標準品：將蛋白質(zhì)標準品（如牛血清白蛋白）按照預設(shè)的濃度梯度進行稀釋,，制備不同濃度的標準品溶液。例如,，取一定體積的高濃度標準品,，用稀釋緩沖液（如 PBS）依次稀釋，得到 0 μg/mL,、200 μg/mL,、400 μg/mL、600 μg/mL,、800 μg/mL,、1000 μg/mL 等濃度的標準品。

加樣與反應(yīng)：在 96 孔板或比色皿中,，分別加入不同濃度的標準品溶液（一般每孔或每份 20 μL）,，同時設(shè)置空白對照（加入等量的稀釋緩沖液替代樣本）。隨后,，向各孔或比色皿中加入 200 μL BCA 工作液,，輕輕振蕩混勻，使溶液充分接觸。將 96 孔板置于 37℃恒溫箱中孵育 30 分鐘,，或在室溫下孵育 2 小時,，使顯色反應(yīng)。

吸光度測定：使用分光光度計,，在 562 nm 波長處測定各標準品溶液和空白對照的吸光度值 ,。以標準品的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標,，繪制標準曲線,。通常采用最小二乘法進行線性擬合，得到標準曲線的方程（y = ax + b,，其中 y 為吸光度值,，x 為蛋白質(zhì)濃度，a 為斜率,，b 為截距） ,。

（二）樣本測定

樣本準備：根據(jù)樣本類型和蛋白質(zhì)濃度預估，對樣本進行適當稀釋,。對于未知濃度的樣本,，可先進行預實驗，選擇合適的稀釋倍數(shù),，確保樣本的吸光度值在標準曲線的線性范圍內(nèi) ,。例如，對于細胞裂解液樣本,，可先進行 10 倍稀釋,，若吸光度值過高，再進一步稀釋,。

加樣與反應(yīng)：在 96 孔板或比色皿中加入 20 μL 稀釋后的樣本溶液,，按照與標準曲線繪制相同的操作步驟，加入 200 μL BCA 工作液,，振蕩混勻后進行孵育,，使樣本中的蛋白質(zhì)與 BCA 試劑充分反應(yīng)顯色。

計算蛋白質(zhì)濃度：測定樣本溶液在 562 nm 處的吸光度值,，將其代入標準曲線方程,，計算出樣本的蛋白質(zhì)濃度。若樣本進行了稀釋,，需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),，得到原始樣本的蛋白質(zhì)濃度。

（三）操作關(guān)鍵注意事項

試劑儲存與使用規(guī)范：嚴格按照產(chǎn)品說明書儲存 BCA 試劑,，A 液和 B 液應(yīng)避光保存,，防止 BCA 和 Cu2?發(fā)生氧化等反應(yīng)而失效 ,。使用前將試劑平衡至室溫，BCA 工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配,，避免因放置時間過長導致顯色性能下降 ,。在加樣過程中，使用移液器準確吸取試劑和樣本,，避免因加樣誤差影響定量結(jié)果,。

樣本處理細節(jié)：確保樣本充分裂解或勻漿，使蛋白質(zhì)釋放到溶液中,，避免因蛋白質(zhì)溶解導致定量結(jié)果偏低 ,。對于含有干擾物質(zhì)（如高濃度去污劑、還原劑）的樣本,，需進行適當?shù)念A處理,，如透析、超濾等方法去除干擾物質(zhì),，或優(yōu)化反應(yīng)條件（如增加 BCA 工作液用量,、延長孵育時間）。

實驗條件控制：孵育溫度和時間對顯色反應(yīng)有顯著影響,，需嚴格按照說明書要求進行操作 ,。在使用 96 孔板進行實驗時，確?？變?nèi)液體分布均勻,，避免因邊緣效應(yīng)導致吸光度值偏差。每次實驗均需重新繪制標準曲線,，以消除實驗誤差,，保證定量結(jié)果的準確性。

儀器校準與維護：使用分光光度計前,，需進行儀器校準，確保波長準確性和吸光度測量精度 ,。定期對儀器進行維護和清潔,，避免因儀器故障或污染影響實驗結(jié)果。

BCA 蛋白定量試劑盒憑借其科學的原理,、優(yōu)良的性能和簡便的操作,，成為生命科學研究中蛋白質(zhì)濃度測定的重要工具?？蒲腥藛T在遵循操作規(guī)范,、合理優(yōu)化實驗條件的基礎(chǔ)上，能夠充分發(fā)揮該試劑盒的優(yōu)勢,，為蛋白質(zhì)相關(guān)研究提供可靠的定量數(shù)據(jù)支持,，推動生命科學領(lǐng)域的深入探索與發(fā)展。

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