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關(guān)鍵詞：Phase Ⅰ Metabolism,，Metabolic Stability，CytochromeP450,，CYP450,，Liver microsomes，Primary hepatocytes

藥物代謝又稱生物轉(zhuǎn)化(biotransformation),，是指藥物被機體吸收后,，在體內(nèi)各種酶以及體液環(huán)境作用下發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變的過程。藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化可分為Ⅰ相代謝反應(yīng)（Phase Ⅰ Metabolism）和Ⅱ相代謝反應(yīng)（Phase Ⅱ Metabolism）,，兩種類型的反應(yīng)都得到極性更強,、水溶性更好的產(chǎn)物，因此它們更易通過膽汁和尿被排泄出體外,。代謝穩(wěn)定性（Metabolic Stability）反映了化合物對生物轉(zhuǎn)化的敏感性,，它會影響化合物的口服生物利用度以及體內(nèi)半衰期，進而影響到化合物在體內(nèi)的安全性和有效性,。因此,，在藥物研發(fā)初期，有必要對藥物的代謝穩(wěn)定性情況進行考察,。與體內(nèi)代謝穩(wěn)定性研究相比,，藥物體外代謝穩(wěn)定性研究可排除體內(nèi)諸多干擾因素的影響，有助于更直接地觀察藥物的代謝特征,，具有省時,、穩(wěn)定、高效的特點,，可用于候選藥物的高通量篩選,。本文簡要介紹藥物體外Ⅰ相代謝穩(wěn)定性體外研究方法及數(shù)據(jù)分析，以供參考。

一,、藥物Ⅰ相代謝介紹

藥物Ⅰ相代謝（Phase Ⅰ Metabolism）是指藥物分子上引入新的基團或除去原有小基團的官能團反應(yīng),，包括氧化、還原和水解等反應(yīng),。Ⅰ相代謝反應(yīng)中最重要的酶系是細胞色素P450（CytochromeP450,，CYP450），屬于單加氧酶（momooxygenase）,，主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中,，能催化烷烴、烯烴,、芳烴和類固醇等多種物質(zhì)進行氧化反應(yīng),。該酶系由細胞色素P450和NADPH-細胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃素蛋白）偶合組成，需要分子氧和還原輔酶Ⅱ（NADPH）參與反應(yīng),，催化基本反應(yīng)為：

單加氧酶能直接激活氧分子,，使其中一個氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環(huán)氧化物，另一個氧原子則被NADPH還原為水,。由于一個氧分子發(fā)揮了兩種功能,，故單加氧酶系又稱為混合功能氧化酶；又因底物的氧化產(chǎn)物是羥化物,，所以又稱為羥化酶,。單加氧酶的反應(yīng)過程見圖1：

圖1 單加氧酶的反應(yīng)過程

此外，參與Ⅰ相代謝過程還原反應(yīng)的酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶,，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類,；參與水解反應(yīng)的酶包括酯酶、酰胺酶,、糖苷酶等,，可分別催化酯類、酰胺類,、糖苷類化合物的水解以降低或消除其生物活性,。

由此可見，Ⅰ相代謝是藥物代謝的重要環(huán)節(jié),，通過Ⅰ相代謝反應(yīng),，藥物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，例如引入或暴露某些官能團（如羥基,、氨基等）,。這些結(jié)構(gòu)改變會使藥物的性質(zhì)產(chǎn)生變化，影響其藥理活性,、毒性以及藥代動力學(xué)特征等,。它在藥物研發(fā),、藥物療效和安全性評估等方面都有著關(guān)鍵意義，如果藥物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性較差,，可能導(dǎo)致在體內(nèi)過快或過慢地代謝,，從而影響藥物的有效性和安全性。因此,，了解待測化合物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性對于選擇具有良好藥代動力學(xué)特征的候選藥物至關(guān)重要,。

二、藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性體外研究方法

由于肝臟是藥物代謝的重要器官,，是機體進行生物轉(zhuǎn)化的主要場所,，富含參與藥物Ⅰ相代謝反應(yīng)的各種酶，因此,，藥物體外代謝穩(wěn)定性研究多以肝臟為模型,。較常使用的肝臟體外代謝模型有肝微粒體（Liver microsomes）和原代肝細胞（Primary hepatocytes）等。

（1）肝微粒體體外溫孵法試驗方法     

肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相代謝酶,，其中最重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng)，在用肝微粒體進行研究時,，如加入相應(yīng)的輔助因子NADPH,，則可重組體外代謝體系，從而通過體外溫孵法進行Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究,。

① 樣本準備：肝微粒體（人,、猴、犬,、大鼠,、小鼠等種屬），試驗體系中微粒體蛋白終濃度建議是在0.1mg/mL-1mg/mL之間,；待測藥物終濃度一般為1μM,，不建議過高。

② 溫孵反應(yīng)：將肝微粒體,、測試藥物溶液以及NADPH再生系統(tǒng)混合于合適的反應(yīng)容器（如小型離心管）中,。通常反應(yīng)體系的體積在200-500μL左右。將反應(yīng)容器置于37°C環(huán)境中孵育一定時間,，如0,，5，10,，15,，30，60 min,。每個樣品平行3次,，同時需設(shè)置空白對照組、陰性對照組和陽性對照組。

③ 終止反應(yīng)與樣本處理：孵育結(jié)束后,，可通過加入有機溶劑（如乙腈等）進行終止反應(yīng),。然后通過離心等手段進行樣本處理，離心條件如13000-15000 rpm離心5-10分鐘,，然后取上清液進行檢測,。

④ 檢測分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技術(shù)檢測樣本中的藥物原形剩余量及其代謝產(chǎn)物,，進而分析藥物的半衰期及固有清除率,，以此評估其在Ⅰ相代謝中的穩(wěn)定性。圖2為采用LC-MS/MS測定某種藥物在人,、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況,，從圖上可知，該藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝,，但不同種屬間又存在顯著差異,。

圖2某種藥物在人、犬,、大鼠肝微粒體中的代謝情況

（2）原代肝細胞體外溫孵法試驗方法

原代肝細胞保持了完整的細胞結(jié)構(gòu),，擁有更完整的代謝酶系統(tǒng)和不同清除途徑的輔酶因子?？刹捎迷渭毎w外溫孵法進行藥物代謝穩(wěn)定性試驗,。

① 原代肝細胞獲取與準備：可以從新鮮肝臟組織通過機械和酶消化等方法獲取原代肝細胞（人、猴,、犬,、大鼠及小鼠等種屬）。分離得到的肝細胞要進行細胞活力檢測,，只有活力較高（一般要求在80%以上）的細胞才適合用于后續(xù)試驗,。反應(yīng)體系中原代肝細胞的濃度可在0.5-2×106/mL之間調(diào)整。

② 溫孵反應(yīng)：將原代肝細胞和測試藥物（建議終濃度為1μM）于適合的條件（如37℃,、5% CO?）下進行孵育一定時間,，如0、15,、30,、60、90,、120min,。

③ 終止反應(yīng)與樣本處理：孵育結(jié)束后，可通過加入有機溶劑（如乙腈等）進行終止反應(yīng),。樣本離心后取上清液進行檢測,。

④ 檢測分析：使用HPLC,、LC-MS/MS等分析技術(shù)檢測樣本中的藥物原形剩余量及其代謝產(chǎn)物，進而分析藥物的半衰期及固有清除率,，以此評估其在Ⅰ相代謝中的穩(wěn)定性,。

由此可見，肝微粒體和原代肝細胞都可通過體外溫孵法進行藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究,。兩者的區(qū)別如下所示,，客戶可根據(jù)實際情況進行選擇。

【肝微粒體使用場景及選擇】

√ 化合物分子水溶性較強,，強烈推薦選擇肝微粒體,。

√Ⅰ相代謝為主要代謝途徑(尤其是經(jīng)由CYP450酶代謝)等情況下，強烈推薦選擇肝微粒體,。

√ 肝微粒體成本相對較低,、易于儲存和使用，操作簡便,，適用于大量化合物的初步篩選,、評估化合物代謝穩(wěn)定性、指導(dǎo)結(jié)構(gòu)修飾等研究,。

√ 肝微粒體缺乏完整的細胞結(jié)構(gòu),，無法模擬藥物的攝取、轉(zhuǎn)運等過程,，試驗結(jié)果可能與體內(nèi)實際情況存在一定差異，需要結(jié)合其他試驗方法進行綜合評估,。

【原代肝細胞適用場景及選擇】

√ 肝微粒體中非特異性蛋白結(jié)合較高時,，可選擇原代肝細胞。

√ 肝微粒體體中代謝不明顯時,，可嘗試使用原代肝細胞,。

√ 化合物主要經(jīng)由醛氧化酶（AO）或者單胺氧化酶（MAO）等非CYP450氧化酶代謝或者水解反應(yīng)為主要代謝途徑時，可選擇原代肝細胞,。

√ Ⅱ相代謝為主要途徑時,，選擇原代肝細胞。

√ 原代肝細胞具有完整的細胞膜結(jié)構(gòu)和各類藥物轉(zhuǎn)運體,，更適用于需要模擬真實體內(nèi)代謝環(huán)境,、評估藥物口服生物利用度、預(yù)測人體清除率等研究,。但原代肝細胞試驗成本較高,，操作相對復(fù)雜，對實驗條件要求較高,。

三,、IPHASE 體外Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)分析

1.代謝正常

一般情況下,，體外代謝穩(wěn)定性試驗的要求是：如果藥物發(fā)生了代謝，則R2>0.9,；3個平行數(shù)據(jù)間的CV%需在15%之內(nèi),，允許有一個時間點超限；如果有2個時間點超限可依據(jù)情況舍點取平均值,；如果底物剩余<5%,，則CV%值沒有限制。如上表所示,，該次試驗符合體外代謝穩(wěn)定性的試驗要求,，是正常代謝的情況?？梢钥闯?，該藥物在肝微粒體中的半衰期是5.54min，體外固有清除率為250μL/mg/min,。

2. 藥物在肝微粒體中不代謝

某次在進行肝微粒體藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性結(jié)果統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn),，隨著時間的延長，藥物的剩余量基本沒有變化,，可認為該藥物在肝微粒體中沒有發(fā)生代謝,。排除產(chǎn)品本身質(zhì)量問題后，可能的原因有：（1）藥物通過非CYP450酶代謝,，而該酶在肝微粒體含量很低,，活性較弱；（2）該藥物主要代謝途徑是Ⅱ相代謝,，可嘗試進行Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試驗觀察結(jié)果,；（3）該藥物為慢代謝藥物，不適合用肝微粒體代謝模型進行試驗,。因此,，針對Ⅱ相代謝的藥物，客戶可以嘗試使用微粒體進行Ⅱ相代謝穩(wěn)定性測試,，也可以更換為原代肝細胞或者肝S9等體外代謝模型,。針對肝微粒體中該藥物代謝酶活性低的情況，則需要選擇原代肝細胞或者肝S9等模型進行測試,。而針對慢代謝藥物,，常規(guī)的微粒體和肝細胞代謝模型無法滿足試驗要求，可以選擇肝細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)進行試驗,。

3. 酶活問題

如上表所示,，在進行肝微粒體Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試驗時發(fā)現(xiàn)，藥物在10min后的代謝情況不明顯,，代謝趨于平緩,，從而在進行數(shù)據(jù)擬合時線性關(guān)系不佳（R2=0.7359＜0.9）,。出現(xiàn)該情況可能的原因有：（1）酶活問題。代謝該藥物的酶在肝微粒體中的含量較低,，活性較弱,，因此在10min后，藥物的代謝趨于平緩,，呈現(xiàn)出基本不代謝的情況,。此時可嘗試適當(dāng)提高體系中微粒體蛋白的濃度再嘗試一下（建議體系中的蛋白濃度≤1mg/mL，蛋白濃度過高會和藥物發(fā)生非特異性結(jié)合）,。（2）產(chǎn)品問題或者批間差異,。產(chǎn)品本身質(zhì)量問題或者批次間的差異所致，可更換不同批次的肝微粒體產(chǎn)品進行試驗,。因此,，發(fā)生該情況后可進行重復(fù)驗證，以找到出現(xiàn)該問題的原因,。

4. 檢測方法或者處理溶劑問題

在實際操作中,，可能會遇到這樣一種情況：隨著孵育時間的延長，在某個時間點后,，底物的剩余量反而增多,，如圖上表中的數(shù)據(jù)一樣，在第10min時,，底物剩余量為97%,，第15min時，底物剩余量增至105%,，之后達到了123%,，針對這一“反常”情況,，我們分析可能的原因有：（1）檢測方法問題。檢測方法不合適,，底物中包含了代謝產(chǎn)物的峰,，導(dǎo)致峰面積變大，此時需要優(yōu)化檢測方法,。（2）處理溶劑問題,。在終止反應(yīng)時所用的有機溶劑不合適，可嘗試更換終止液（如由乙腈更換為甲醇等）,。

綜上所述,，代謝穩(wěn)定性是影響化合物暴露量和生物利用度的主要因素之一，在藥物的有效性和安全性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,。因此,，在藥物研發(fā)初期,，進行體外代謝穩(wěn)定性試驗對于預(yù)測人體內(nèi)清除率、篩選優(yōu)勢化合物及構(gòu)建IVIVE模型等方面具有重要意義,。

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，以肝微粒體體外溫孵法為指導(dǎo)，開發(fā)了一款專門用于Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的試劑盒,，該產(chǎn)品可直接用于藥物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究,，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期,，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測,，符合Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究試驗要求，實驗結(jié)果準確,、可靠,、重現(xiàn)性好。除試劑盒外,，IPHASE 還可提供人,、猴、犬,、大鼠及小鼠等不同種屬的的肝微粒體和原代肝細胞,，助力廣大客戶進行藥物代謝穩(wěn)定性研究。

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