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Keywords：原代肝細(xì)胞,；Primary Hepatocytes; 肝細(xì)胞分離,；肝細(xì)胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol；Isolation of Primary Hepatocytes

肝臟作為藥物暴露的主要器官,，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用,。原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細(xì)胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】,，也包括胞質(zhì)酯酶,，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此,，原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認(rèn)為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn),，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。

一,、原代肝細(xì)胞分離方法

肝細(xì)胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細(xì)胞提取提取有直接剪切法,、組織塊培養(yǎng)法、胰蛋白酶消化法,、兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）,、半原位膠原酶灌注法等。

【直接剪切法】

原理：將肝臟切成小塊,，然后用膠原酶或胰蛋白酶進(jìn)行消化,，分離得到肝細(xì)胞。

優(yōu)點：操作簡單,，適用于大量細(xì)胞的分離,。

缺點：細(xì)胞損傷較大，純度較低,。

【組織塊培養(yǎng)法】

原理：將肝臟切成小塊,，在培養(yǎng)皿中加入含特定生長因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，使組織塊貼壁生長,，然后逐漸分離得到肝細(xì)胞,。

優(yōu)點：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài)，適用于長期培養(yǎng),。

缺點：操作較為繁瑣,，細(xì)胞數(shù)量較少。

【胰蛋白酶消化法】

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原理：用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進(jìn)行消化,，分離得到肝細(xì)胞,。

優(yōu)點：能夠較為徹-底地分解細(xì)胞間物質(zhì)，獲得較純的肝細(xì)胞,。

缺點：胰蛋白酶的價格較貴,，成本較高。

【兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）】

原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中,，使肝實質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)分開,，然后收集分離得到肝實質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)點：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài),，適用于長期培養(yǎng),。

缺點：操作較為繁瑣，細(xì)胞數(shù)量較少,。

【半原位膠原酶灌注法】

原理：將肝臟放置在特定裝置中,，通過門靜脈灌注膠原酶溶液，使肝臟在生理狀態(tài)下進(jìn)行消化,，然后收集分離得到肝實質(zhì)細(xì)胞,。

優(yōu)點：能夠較為真實地模擬生理狀態(tài)，獲得的細(xì)胞形態(tài)、活性較好,。

缺點：操作較為復(fù)雜,，成本較高,。

其中,，兩步膠原酶灌流法因其對肝細(xì)胞損傷作用較小，肝細(xì)胞產(chǎn)率和存活率高,，成為了分離原代肝細(xì)胞的經(jīng)典方法,。

二、原代肝細(xì)胞分離流程

鑒于此,，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，在兩步膠原酶灌注的基礎(chǔ)上，開發(fā)了原代肝細(xì)胞分離試劑盒,，有標(biāo)準(zhǔn)的分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）,，其內(nèi)整合了包括灌流液、膠原酶,、細(xì)胞洗滌液,、細(xì)胞純化液、試驗耗材等在內(nèi)的所有組分,，可適用于大鼠,、小鼠等多個種屬原代肝細(xì)胞的分離。以下為詳細(xì)實驗流程：

1,、實驗材料

1)動物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠

2)儀器：恒溫水浴鍋,、水平離心機(jī)、移液器,、生物安全柜

3)試劑：膠原酶,、灌流溶液A、灌流溶液B,、消化終止液,、分離液添加劑、肝細(xì)胞純化液

4)耗材：0.22um過濾器,、20ml無菌注射器,、10ml無菌注射器、5ml無菌注射器,、無菌紗布,、無菌剪刀、無菌鑷子,、無菌燒杯,、無菌擦手紙、無菌50mL離心管及巴氏吸管

2、試劑預(yù)處理

1)灌流溶液A：實驗前37℃水浴預(yù)熱30分鐘,。

2)灌流溶液B：實驗前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶,，充分溶解后用0.22µm過濾器過濾。過濾后的溶液加入100uL分離液添加劑,，然后37℃水浴預(yù)熱30分鐘,。

3)消化終止液：實驗前在無菌條件下，每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑,，混勻后置于冰上備用,。

3、實驗步驟及結(jié)果

(一)  肝臟獲取

1)盡可能于半分鐘內(nèi)將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進(jìn)行全身消毒,，并轉(zhuǎn)移至生物安全柜中,。

2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起，并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開,，以裸露腹部肌肉部位,。

3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開，使肝臟充分暴露,，注意不要將大鼠內(nèi)臟器官剪破,。

(二)  組織處理

1)用剪刀剪開圖A所示位置，剪至能清晰可見每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔,，使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A,，將每葉肝臟都灌注至土黃色。

2)使用10mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液B,，直至肝臟軟爛,。

(三)  細(xì)胞獲取

1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀，補(bǔ)加灌流溶液B至30mL.

2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌,。

3)消化結(jié)束后按照混懸液與消化終止液1：1的比例加入消化終止液,。

4)無菌紗布過濾即得肝細(xì)胞懸液。

(四)  細(xì)胞洗滌

1)將肝細(xì)胞懸液輕輕顛倒混勻,，分裝至50mL離心管,。

2)70g（升速 3、降速 3）,、4℃離心 5min,。

3)在超凈工作臺中棄上清，消化終止液重懸細(xì)胞沉淀,。

(五)   細(xì)胞純化

1)按照 7：3 的比例（即細(xì)胞懸液：肝細(xì)胞純化液）加入肝細(xì)胞純化液并混勻,。

2)100g（升速 3、降速 3）,、4℃離心 10min,。

3)棄上清,，使用凍存液將細(xì)胞重懸，并于液氮罐中保存,。

如圖所示,，該圖為IPHASE技術(shù)人員此次共分離得到的SD大鼠新鮮肝細(xì)胞照片，經(jīng)0.4%臺盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活率在90%以上,，且數(shù)量共有80million,，說明以IPHASE原代肝細(xì)胞分離試劑盒為提取材料，可獲得純度高,、活率好且數(shù)量多的新鮮原代肝細(xì)胞,！

三,、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，深刻識到原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，在藥物相互作用,、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞,。因此，在兩步膠原酶灌注法的基礎(chǔ)上研發(fā)了原代肝細(xì)胞分離試劑盒,，在標(biāo)準(zhǔn)的肝細(xì)胞分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下進(jìn)行肝細(xì)胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細(xì)胞提取,，并以SD大鼠為實例，證明該試劑盒,、該方法具有實用性,！除此以外，IPHASE以相似分離流程,，研發(fā),、生產(chǎn)了多種屬、多規(guī)格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細(xì)胞,，供客戶購買使用,，為客戶縮短時間，節(jié)約成本,！

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢：

合規(guī)性：生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得,，來源清晰。

安全性：生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測,，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全,。

高質(zhì)量：生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多,，批次間差異性小,。

可定制：可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬肝細(xì)胞的定制服務(wù),。

發(fā)    文    章    得    獎    勵

凡使用本公司產(chǎn)品,，在國內(nèi)及國際刊物上發(fā)表論文（論文發(fā)表日起一年內(nèi)）,，并注明產(chǎn)品屬于我司所有，即可申請獎勵,。根據(jù)發(fā)表刊物影響因子不同,，給予不同金額獎品：

非SCI論文及IF≤5分，500元禮品,；

5分＜IF≤8分 800元禮品,；

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IF≥10分 2000元禮品,；

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【中文簡稱】匯智和源

【中文全稱】匯智和源生物技術(shù)（蘇州）有限公司

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