人活性氧簇（ROS）酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
 
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清,、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中活性氧簇（ROS）含量,。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中ROS水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入ROS,、生物素化的抗人ROS抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ROS呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為1,000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成1,000 pg/ml,， 500 pg/ml,，250 pg/ml，125 pg/ml,，62.5 pg/ml,，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml,，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制500 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 1,000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
標(biāo)本的采集及保存
1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測,。

操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。
為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干,。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃,，60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
2．為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。
3.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
4.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將*的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人ROS,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
注意事項
1． 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。
2． 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，*使用排槍加樣,。
3． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。
4． 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。
6．底物請避光保存。

說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4. 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
6. 中,、英文說明書可能會有不*之處,，請以英文說明書為準(zhǔn)。
7. 所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8. 有效期：6個月