端粒是真核生物染色體末端的特異DNA-蛋白結(jié)構(gòu),端粒DNA是一系列重復(fù)的富含G的DNA序列,,這一序列在生物進(jìn)化中有高度的保守性(人重復(fù)序列為TTAGGG),。已確認(rèn)端粒在保護(hù)基因組DNA不被降解、防止染色體有害的結(jié)合(如染色體末端融合,、重排,、染色體移位和染色體缺失)中起重要作用。
由于DNA聚合酶不能復(fù)制線性DNA的zui末端,,多數(shù)正常體細(xì)胞的端粒末端每經(jīng)一個復(fù)制循環(huán)就進(jìn)行性縮短,。這一現(xiàn)象在體內(nèi)和體外都得到證實,,并且可能與真核生物的正常體細(xì)胞有限的繁殖能力有關(guān),。
這一活性可能在與細(xì)胞衰老有關(guān)的情況中起作用。與體細(xì)胞相對照,,生殖細(xì)胞是永生性的,,它需要為將來器官形成保存全部的遺傳信息。因此它必須對抗端??s短,。這一工作通過在基因組染色體的末端添加新的端粒重復(fù)序列而完成。
端粒酶是一種核糖核蛋白,,它們用自身的RNA成份的互補序列作模板,,催化TTAGGG重復(fù)序列加到染色體末端。在大多數(shù)永生性細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞株中也可見端粒酶活性的表達(dá),。端粒酶反應(yīng)超越了細(xì)胞的增殖限制,,這可能是惡性腫瘤發(fā)生的一個先決條件。
傳統(tǒng)的端粒酶研究方法是以探針延伸為基礎(chǔ)測定端粒酶活性,。由于需要大量的樣品材料,,且檢驗靈敏度受局限,這一方法已被端粒重復(fù)擴(kuò)增法(omeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)所取代,。
標(biāo)準(zhǔn)的TRAP測定是通過PCR擴(kuò)增端粒酶反應(yīng)的產(chǎn)物,使用放射性標(biāo)記,,經(jīng)凝膠電泳后,,通過放射自顯影顯示結(jié)果。
這里介紹使用非放射性標(biāo)記的檢測端粒酶的新方法:活性光密度酶聯(lián)免疫測定法,。這種方法具有如下特點:
安全,,無需使用放射性同位素
一步反應(yīng),使用即用的混合物使端粒酶介導(dǎo)的引物延伸和PCR擴(kuò)增可在一個試管中進(jìn)行,。
應(yīng)用廣泛,,擴(kuò)增后可適用于不同分析法。
靈敏,,與放射性同位素TRAP測定相當(dāng),。
可靠,準(zhǔn)確,、重復(fù)性好,。
快速,6-8小時得到結(jié)果,。
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