細(xì)胞培養(yǎng)是用無(wú)菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織（或器官）取出,，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件,，在體外進(jìn)行培養(yǎng)．使其不斷地生長(zhǎng)、繁殖,，人們借以觀察細(xì)胞的生長(zhǎng),、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過(guò)程的生命現(xiàn)象,。

細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn),，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分化等的影響,；二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞骨架等）,、細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育等過(guò)程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的—種簡(jiǎn)便易行的實(shí)驗(yàn)技術(shù),，同時(shí)我們也不可忽略的另一個(gè)因素,，那就是它脫離樂(lè)生物機(jī)體后的—些變化。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,。如分子生物學(xué),、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué),、免疫學(xué),、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等

為此有必要使學(xué)生在細(xì)胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識(shí),，了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過(guò)程，觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特征,，對(duì)原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞有一個(gè)基本概念,。

本實(shí)驗(yàn)分兩次進(jìn)行．即清洗與消毒和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察。

Ⅰ清洗與滅菌

一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?span lang="EN-US">

能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒,，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過(guò)除菌法的操作,，了解化學(xué)消毒法的使用方法,。

二、實(shí)驗(yàn)原理

清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的*步,，是組織培養(yǎng)中工作量zui大,，也是zui基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無(wú)菌的要求程度很高,。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不*有很大關(guān)系,。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明,，無(wú)油跡,，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì),，哪怕殘留0．1個(gè),，也可能影響細(xì)胞生長(zhǎng),。滅菌手段的選擇十分重要,，對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì),，即使達(dá)到了無(wú)菌卻使被滅菌藥品喪失了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍,。

三,、實(shí)驗(yàn)材料、用品

材料：無(wú)臭氧型紫外燈,，微孔濾膜（直徑25）：孔徑為0．22μm,，微孔濾膜（直徑90）：孔徑為0．22 μm，過(guò)濾器（直徑25）,。

藥品：70％或75％酒精,，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液（來(lái)蘇兒水）,，0．5％過(guò)氧乙酸,，乳酸,，37％甲醛，高錳酸鉀,，NaOH,，鹽酸，重鉻酸鉀,，濃硫酸（工業(yè)）,，DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0．1％的焦炭酸二乙酯（diethylpyroearbonate）]。

儀器：超凈臺(tái),，干燥箱,，高壓鍋，過(guò)濾器,，過(guò)濾泵,。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）清洗

1．新玻璃器皿的清洗先用自來(lái)水刷洗,，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì),。

2．使用過(guò)的玻璃器皿的清洗

（1）使用過(guò)的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗,。

（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿,，自來(lái)水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥,。

（3）浸酸性洗液過(guò)夜,。

（4）從酸性洗液撈出后自來(lái)水沖洗10．15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次,，倒置烘干,。

（5）包裝（牛皮紙或一般紙）。

（6）高壓（15磅20 min）或干熱（170℃2 h）滅菌,。

（7）貯存?zhèn)溆谩?span lang="EN-US">

3．膠塞的處理

（1）新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min,。

（2）自來(lái)水清洗10次。

（3）再用1％稀鹽酸浸泡30 min,。

（4）自來(lái)水清洗10次,，蒸餾水涮洗3次。晾干,，高壓滅菌（見(jiàn)（二）消毒與滅菌）,。舊膠塞不*酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過(guò)蒸餾水,，晾干,，包裝并高壓滅菌后，便可使用,。

（二）消毒

1．物理消毒法

（1）紫外線消毒 用于消毒空氣,、操作臺(tái)面和一些不能用干熱,、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿,、培養(yǎng)板等,。這是常使用的消毒方法之一。

（2）干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌,。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi),，加熱至160℃，保溫90－120 min,。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需180℃,，保溫5－8 h。

（3）濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌,，是zui有效的一種滅菌方法,。主要應(yīng)用范圍是布類(lèi)、橡膠制品（如膠塞）,、金屬器械,、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無(wú)機(jī)溶液（如Hanks液,、PBS,、20×SSC等）。手動(dòng)高壓滅菌鍋操作如下：

①首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足,，放人物品蓋好蓋,。

②加熱高壓鍋。將放氣閥打開(kāi),，放氣5—10 min,，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。

③待鍋內(nèi)水沸騰后,，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓,，玻璃器皿等用15磅（121℃）30 min,，膠塞,、塑料制品、溶液等可用10磅（115 ℃）20 min,。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。

④停止加熱,，待壓力自然下降至0再打開(kāi)放氣閥排汽,，開(kāi)蓋，取出高壓滅菌的物品烘干,。

電熱自動(dòng)滅菌鍋使用說(shuō)明（型號(hào)：SANYO Autoclave MLS-3020）：

①放氣筒加水至LOW水平線處,，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位,。

②打開(kāi)高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線,，水位線位于V型凹槽的1／3－2／3處。

③打開(kāi)電源,。

④設(shè)定高壓溫度及時(shí)間,，高壓鍋的溫度范圍為105－121℃,，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min,。

⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內(nèi)，順時(shí)針?lè)较驅(qū)?span lang="EN-US">exhaust鈕旋至close位置,。

⑥關(guān)閉高壓鍋蓋,，旋至顯示屏上左上角的紅亮點(diǎn)剛出現(xiàn)為止。

⑦按start鈕,，開(kāi)始高壓,，在溫度達(dá)80℃時(shí)顯示器開(kāi)始顯示溫度，當(dāng)溫度達(dá)到所需的設(shè)定溫度時(shí),，在顯示屏的左下角有一長(zhǎng)形的指示燈閃亮,，直到高壓時(shí)間結(jié)束后指示燈滅，此時(shí)蜂鳴器報(bào)警一聲,。當(dāng)壓力降至0 MPa時(shí),，蜂鳴器再報(bào)警一聲。溫度降至80℃時(shí),，蜂鳴器報(bào)警10次,。顯示屏溫度指示消失，此時(shí)才可打開(kāi)鍋蓋,。

⑧關(guān)電源,，開(kāi)高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品,，烘干,。

（4）濾過(guò)除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜,，極大地方便了操作,。濾器型號(hào)按直徑大小劃分。如過(guò)濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號(hào)的金屬濾器（直徑90 mm,、100 mm,、142 mm……等），配以過(guò)濾泵使用,。過(guò)濾量較小的液體常用注射器推動(dòng)的塑料小濾器（直徑20 mm,、25 mm等）。濾膜孔徑有0．60 μm,、0．45 μm,、0．35 μm、0．22 μm,、0．10μm等,，以0．22 μm除菌zui為保險(xiǎn)，但對(duì)于較粘稠難濾過(guò)的液體,，仍需選用孔徑較大的濾膜,。

①在過(guò)濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0．22μm,。

②用布包好,，濕熱滅菌后使用。

2．化學(xué)消毒法

常用的消毒液有如下幾種：

（1）70％（或75％）酒精：超凈臺(tái)里常備70％酒精棉球（衛(wèi)生級(jí)酒精）,，用于手和一些金屬器械或工作臺(tái)面的消毒,。

（2）0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺(tái)面的清潔。超凈臺(tái)旁應(yīng)常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布,。

（3）來(lái)蘇兒水（煤酚皂溶液）：主要用于無(wú)菌室桌椅,、墻壁、地面的消毒和清洗,，以及空氣噴撒消毒,，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請(qǐng)按瓶上說(shuō)明,。

（4）0．5％過(guò)氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑,，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒,，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行,。

（5）乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止,。將門(mén)窗緊閉1—3 d,。可將空氣中漂浮的微生物殺死。

（6）37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門(mén)窗,。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火,。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣,。1—3 d后方可達(dá)到消毒空氣的目的,。

3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用,。

五,、注意事項(xiàng)

1．清洗玻璃制品時(shí)，浸酸之后一定要用自來(lái)水沖洗10—15次,。因?yàn)闅埓娴南匆簩?duì)細(xì)胞粘附有很大影響,。清洗塑料制品時(shí)要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬(wàn)不要用硬毛刷,，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁,。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個(gè)清洗。如沒(méi)有洗凈會(huì)影響下一次使用的效果,。

2．干熱滅菌時(shí),，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察,，以免發(fā)生意外,。當(dāng)溫度超過(guò)100℃時(shí)，不能再打開(kāi)烤箱門(mén),。器皿烤完后,，待溫度降至100℃之下才能開(kāi)烤箱門(mén)。金屬器械和橡膠,、塑料制品不能使用干熱滅菌方法,。．

3．高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉,。

4．牛血清,、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液,，均不能高壓（如TdR,，秋水仙素，谷氨酰胺,，異硫氰酸胍,，MOPS等）。

5．濾過(guò)除菌時(shí),，濾器在使用前先裝好濾膜（有時(shí)可在上面加一層定性濾紙）,，包好,，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過(guò)酶類(lèi)制劑時(shí)應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進(jìn)行,。過(guò)濾時(shí)壓力不宜過(guò)大,，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時(shí)微孔濾膜可能破裂,，或使某些微生物變形而通過(guò)濾膜,。裝濾膜時(shí)位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時(shí),，螺釘不要擰得太緊,，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后,，再擰緊使用,。

6．使用化學(xué)消毒法時(shí)，配制75％酒精應(yīng)用衛(wèi)生級(jí),，不要用化學(xué)純,、分析純和純酒精。來(lái)蘇兒水不能用于皮膚消毒,，它對(duì)皮膚有刺激性,。空氣消毒時(shí),，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑,。因?yàn)榧兹┗蛉樗峒訜岷蠓懦龅恼魵鈱?duì)人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。

六,、思考題

1．哪些物品適合于高壓滅菌,，并說(shuō)明理由。

2．紫外線消毒的適用范圍和目的是什么?

II,、傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

了解傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過(guò)程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況

二,、實(shí)驗(yàn)原理

傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移,，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。

這種培養(yǎng),，*步也是制備細(xì)胞懸液,，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層時(shí)，它很容易被蛋白水解酶和EDTA）所破壞,。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA（乙二胺四乙酸鹽）的混合物,，做為消化液。

細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù),。要使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng),，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件,，如適量的水、無(wú)機(jī)鹽,、氨基酸,、維生素,、葡萄糖及其有關(guān)的生長(zhǎng)因子,、氧氣、適宜的溫度,，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié),。二是嚴(yán)格控制無(wú)菌條件。

三,、實(shí)驗(yàn)用品

1,、器材

解剖剪、解剖鑷,、眼科剪（尖頭,、彎頭）、眼科鑷（尖頭,、彎頭）,、培養(yǎng)皿、量筒,、試管,、錐形瓶、吸管,、橡皮頭,、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均須*清洗,、烤干,、包裝好，9．9xl0⁴Pa（15磅）滅菌30min備用,。

此外,，還有顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器,、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,、酒精燈、酒精棉球,、碘酒棉球,、試管架、標(biāo)記筆,、解剖板等,。

2,、試劑

L磷酸鹽緩沖液（PBs）

無(wú)鈣、鎂溶液

細(xì)胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTA

EMEM液

3%谷氨酰胺

o．5％臺(tái)盤(pán)藍(lán)染液等

3,、材料

喉癌細(xì)胞

四,、實(shí)驗(yàn)方法

在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下,，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長(zhǎng)成致密單層,，如已長(zhǎng)成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng),。

1.營(yíng)養(yǎng)液配制:

EMEM液                                90%

犢牛血清                              10%

雙抗（1萬(wàn)單位／m1）               加至約100單位／m1

3％谷氛酞胺                           1m1

7．4％NaHCO₃                    調(diào)pH至6．8—7．0

2．換液:

在酒精燈旁打開(kāi)瓶塞,，倒去瓶中的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液。

3.消化與分裝

在上述瓶中加入1mlEDTA溶液,，輕輕搖動(dòng),，將溶液倒出。重復(fù)上述動(dòng)作,。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o．5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細(xì)胞為宜,，置于室溫，停留1—2min后,，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙（針孔大小的空隙），如出現(xiàn)縫隙,，即可倒去消化液,；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回,，繼續(xù)進(jìn)行消化,，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時(shí),，可倒去消化液,，加入新配制的營(yíng)養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營(yíng)養(yǎng)液,，反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層至瓶壁細(xì)胞全部脫落下來(lái)為止,。此時(shí)，可繼續(xù)輕輕地吹打細(xì)胞懸液,，以使細(xì)胞散開(kāi),。隨之進(jìn)行分裝。

4．培養(yǎng)

分裝好的細(xì)胞瓶上,，做好標(biāo)志,，注明細(xì)胞代號(hào),、日期,。置于培養(yǎng)架上,，輕搖使細(xì)胞均勻分布,，以免堆積成團(tuán)。然后置于37℃培養(yǎng),。

5.觀察

（1）觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個(gè)問(wèn)題,；

細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察,，觀察的重點(diǎn)如下：

A.首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染,。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度

B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長(zhǎng)。

C.如細(xì)胞已生長(zhǎng),，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長(zhǎng)階段,。觀察時(shí)可參照（2）的描述進(jìn)行,。

D．觀察完畢,，可用臺(tái)盤(pán)藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死,、活細(xì)胞的比例,。

（2）細(xì)胞的生長(zhǎng)階段及其形態(tài)特征

傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進(jìn)行觀察，注意細(xì)胞有無(wú)污染,，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長(zhǎng)的情況,。—般中層培養(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開(kāi)始,，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng),、繁殖、衰老及死亡的全過(guò)程,。它是一個(gè)連續(xù)的生長(zhǎng)過(guò)程,，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個(gè)時(shí)期,，但各期間無(wú)明顯界限?，F(xiàn)分別描述如下：

A．游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性,。所以,，此時(shí)細(xì)胞多為圓形，折光率高,，此期可延續(xù)數(shù)h,。

B．吸附期（貼壁）：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時(shí)間（約7—8h）后,，便附著在瓶壁上（此期不同細(xì)胞所需時(shí)間不同）,。在顯微鏡下觀察時(shí)可見(jiàn)瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形,、扁形,、短菱形,。細(xì)胞的特點(diǎn)，大多立體感強(qiáng),，細(xì)胞內(nèi)顆粒少,，透明。

C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h,，細(xì)胞進(jìn)入繁殖期,，加速了細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。此期包括由幾個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞島（即由少數(shù)細(xì)胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細(xì)胞群,，常散在地分布在瓶壁上）,，到細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁（即所謂形成細(xì)胞單層）的過(guò)程。此期細(xì)胞形態(tài)為多角形（呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞的特征）,。細(xì)胞特點(diǎn)：透明,，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚,，并可隱約見(jiàn)到細(xì)胞核,。根據(jù)細(xì)胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長(zhǎng)狀況分為四級(jí),。以“十”的多少表示如下：

十：細(xì)胞占瓶壁有效面積（也就是細(xì)胞能生長(zhǎng)的瓶壁面積）的25％以內(nèi)有新生細(xì)胞,。一般要觀察3—5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，然后加以綜合分析判斷,。

十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的25—75％以內(nèi)具新生細(xì)胞,。

十十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細(xì)胞。細(xì)胞排列致密,。但仍有空隙,。

十十十十：細(xì)胞占瓶壁95％以上，細(xì)胞已長(zhǎng)滿或接近長(zhǎng)滿單層,，細(xì)胞致密,，透明度好。

從十十一十十十十為細(xì)胞的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期（或稱為指數(shù)增長(zhǎng)期）,。

D．維持期：當(dāng)細(xì)胞形成良好單層后,，細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂都減緩，并逐漸停止生長(zhǎng),，這種現(xiàn)象被稱為細(xì)胞生長(zhǎng)的接觸抑制,。此時(shí)細(xì)胞界限逐漸模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多,，且透明度降低,，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸,。此時(shí)營(yíng)養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色,。

E．衰退期：由于溶液中營(yíng)養(yǎng)的減少和日齡的增長(zhǎng)，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素,，此時(shí)細(xì)胞間可出現(xiàn)空隙,，細(xì)胞中顆粒進(jìn)一步增多，透明度更低,，立體感很差,。若將細(xì)胞經(jīng)固定染色處理后，可見(jiàn)細(xì)胞中有大而多的脂肪滴及液泡,。zui后,，細(xì)胞皺縮，逐漸死亡,，從瓶壁上脫落下來(lái),。

五、思 考 題

1．簡(jiǎn)述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意鄉(xiāng)項(xiàng),。

3．細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么?

3．簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長(zhǎng)階段,。

實(shí)驗(yàn)二 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)

一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的技術(shù)性強(qiáng),，要求無(wú)菌操作,，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可初步掌握常規(guī)的組織培養(yǎng)技術(shù)，加深對(duì)無(wú)菌操作的了解,。

 二．實(shí)驗(yàn)原理

植物的性：植物體的任何一個(gè)細(xì)胞都具有生長(zhǎng)分化成為一個(gè)完整植株的能力,，稱為植物的性。

植物組織培養(yǎng)就是利用植物的性進(jìn)行離體無(wú)菌植物培養(yǎng)的一門(mén)技術(shù),。植物組織培養(yǎng)按其原始意義,，就是指愈傷組織培養(yǎng)。但發(fā)展至今,，其范圍日益擴(kuò)大,，已包括植物和它的離體器官、組織,、細(xì)胞和原生質(zhì)體的離體無(wú)菌培養(yǎng),。因此，擁有幾種不同水平的培養(yǎng)技術(shù),，即整體的,、器官的、組織的,、細(xì)胞的和原生質(zhì)的培養(yǎng)技術(shù),。

     本實(shí)驗(yàn)選擇豌豆為材料，豌豆（Pisum sativum）屬豆科植物,，是糧食,、飼料和重要的蔬菜作物,，也是遺傳學(xué)家和植物生理學(xué)家感興趣和樂(lè)于采用的實(shí)驗(yàn)植物，豌豆的根,、莖,、子葉、下胚軸,、上胚軸,、花芽等外植體，皆可形成愈傷組織,，其中莖尖,、幼胚、幼葉等器官可成功的再生成植株,。莖尖培養(yǎng)可包括小至十幾微米的莖尖分生組織（生長(zhǎng)點(diǎn)）和大至幾十毫米的莖尖或更大的芽培養(yǎng),。在實(shí)踐應(yīng)用上，常采用生長(zhǎng)點(diǎn)的培養(yǎng)使患病植物去病毒,，以達(dá)到挽救優(yōu)良品種,，提高產(chǎn)量和質(zhì)量之目的。

 三．實(shí)驗(yàn)材料

儀器設(shè)備：1．酒精燈,、三角燒瓶,，培養(yǎng)皿；2．鑷子,、剪刀,、剖針；3．雙筒解剖顯微鏡,；4．光照培養(yǎng)箱或溫室,；

材料  煙草無(wú)菌苗、豌豆幼苗,。

試劑

（1）MS培養(yǎng)基,，植物激素：NAA、6-BA等,；

（2）飽和漂白粉液（次氯酸鈉）,；

（3）70%酒精、100%酒精,、酒精棉球,；

（4）無(wú)菌水 

四．實(shí)驗(yàn)步驟

豌豆苗的莖尖培養(yǎng)

 ⑴ 取發(fā)芽6天的豌豆幼苗10株，簡(jiǎn)取1厘米左右的莖尖,，浸入70%的酒精中1分鐘,，再浸入飽和次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，（此步以后要求無(wú)菌）用無(wú)菌水中沖洗5次，在滅菌的濾紙上吸干水分,，放入滅菌的培養(yǎng)皿中,。

⑵ 在雙目解剖鏡下，用滅菌的解剖針剝?nèi)ビ兹~露出生長(zhǎng)錐,，用滅菌的解剖針挑取帶著兩至三個(gè)葉原基的生長(zhǎng)錐,。

⑶ 將挑好的莖尖移到MS+10.7μmol/L萘乙酸（NAA）+4.4μmol/L 6-芐基腺嘌呤（6-BA）的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成，用封口膜將培養(yǎng)皿封好,。

（4）在恒溫培養(yǎng)箱中,，26℃下,培養(yǎng)六周，形成愈傷組織,，經(jīng)繼代后,，可用于生根培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)三 酵母菌細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?span lang="EN-US">

學(xué)習(xí)酵母菌原生質(zhì)體制備和再生技術(shù),，為了解酵母菌為材料的外源基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)奠定基礎(chǔ),。

二、實(shí)驗(yàn)原理

酵母菌如釀酒酵母,，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究中有很大作用,，尤其是近些年來(lái)，隨著科技的進(jìn)步,，酵母菌的遺傳操作如轉(zhuǎn)化,、基因克隆和外源基因在酵母受體中的表達(dá)等技術(shù)都有了突破性的進(jìn)展。作為受體系統(tǒng)的酵母菌原生質(zhì)體在這些技術(shù)中有*的地位,。這種經(jīng)溶菌酶處理脫壁后的細(xì)胞（脫壁不*者稱原生質(zhì)球）既可以作為不同種屬間細(xì)胞融合的母體,，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器等大結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移，又可作為外源基因轉(zhuǎn)移的受體,，大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率。這些新技術(shù)不僅促進(jìn)了酵母菌遺傳學(xué)的發(fā)展,，而且很多已應(yīng)用到構(gòu)建新的釀酒業(yè)酵母,。

本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母為材料，進(jìn)行原生質(zhì)體的分離制備和再生,。酵母菌原生質(zhì)體的制備一般采用蝸牛酶,、酵母溶菌酶或其它細(xì)胞壁溶解酶類(lèi)。分離制備過(guò)程受許多因素的影響,，如不同菌株的生長(zhǎng)期,、細(xì)胞濃度、溶菌酶類(lèi)型和用量,、處理時(shí)間和溫度等,。所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)計(jì)應(yīng)綜合考慮各種因素，才能獲得較好的效果。分離制備的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)脑偕囵B(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),，可以再生出細(xì)胞壁而恢復(fù)完整細(xì)胞狀態(tài),，即完成再生過(guò)程，這也是以原生質(zhì)體為受體的所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)zui終能實(shí)現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵步驟,。

在原生質(zhì)體制備中,，應(yīng)選用適當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)期的菌體作為分離的材料。一般來(lái)說(shuō),，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母菌細(xì)胞易脫壁,，靜止期細(xì)胞較難甚至不可能形成原生質(zhì)體。而不同菌種的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期也略有差異,，一般在12～16小時(shí)之間（10⁸細(xì)胞/ml）,。制成的原生質(zhì)體懸浮液在0℃條件下保存4～6小時(shí)，不會(huì)影響融合再生率,。所以欲進(jìn)行原生質(zhì)體融合,，應(yīng)在制備后盡快進(jìn)行，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，影響再生,。

分離過(guò)程中采用的β-巰基乙醇可使細(xì)胞壁組分中的二硫鍵破壞，使蝸牛酶易于分解細(xì)胞壁,。此外,，滲透壓的調(diào)節(jié)可用0.8mol/L山梨醇、16％蔗糖,，或者0.6mol/L KCl溶液,。

三、實(shí)驗(yàn)材料

菌種：釀酒酵母SP-48,、L-酵母：　　

器具和試劑：

恒溫?fù)u床,、恒溫水浴、顯微鏡,、臺(tái)式離心機(jī),、培養(yǎng)皿、試管,、過(guò)濾滅菌裝置,。

液體YEPD：1000 ml 分裝四瓶（蛋白胨 2%  葡萄糖 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

高滲YEPDS：1000 ml （加入  kcl  52.5 g）  YEPD 液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂

PB：2000 ml                                                                                                                                                                                 

 檸檬酸：21克溶于1000毫升蒸餾水中   磷酸氫二鈉：143.256克溶于2000毫升蒸餾水中 

        取檸檬酸溶液678毫升 取磷酸氫二鈉溶液1322毫升 混合得2000毫升PB

高滲PB：取1000毫升PB加入KCL52.185克

PEG-CaCl：聚乙二醇6000  40克 加入至100毫升高滲PB溶液中 使氯化鈣為0.4mol/l

0.2%β-巰基乙醇，無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾.

蝸牛酶液:1.5% 蝸牛酶用高滲PB緩沖溶液配制,，無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾.

淀粉YEPDS：1000 ml （加入  kcl  52.5 g）  YEPD 液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂（蛋白胨 2%  淀粉 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

四,、實(shí)驗(yàn)步驟

　　整個(gè)分離制備和再生過(guò)程于無(wú)菌條件下操作。

1.原生質(zhì)體的制備:

（1）   菌種培養(yǎng):將酵母菌sp-48和L-酵母活化轉(zhuǎn)接新鮮斜面.自新鮮斜面分別挑取一環(huán)sp-48酵母和L-酵母轉(zhuǎn)接入250ml*培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)16-18h.

（2）   收集細(xì)胞：取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液5ml,4000r/min離心10min,，棄上清液.檸檬酸-磷酸緩沖液（PB）洗兩次,，收集菌體

（3）   預(yù)處理：取5ml0.2%β-巰基乙醇PB緩沖液于裝有酵母泥的離心管中,30℃保溫10min,以1000轉(zhuǎn)/分離心10min,傾去上清液

（4）   脫壁：在裝有處理過(guò)的SP－48,L-酵母菌泥的兩只離心管中,，分別加入5ml 1.5%蝸牛酶-PB溶液置30℃水浴中處理,取樣鏡檢,當(dāng) 80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體 2500r/min離心10min,用PB液離心洗滌，洗去酶液,，加入4ml高滲PB液制成10⁶/ml以上的原生質(zhì)體液,測(cè)定形成率

原生質(zhì)體形成率=（酶解前菌落計(jì)數(shù)-未形成原生質(zhì)體菌數(shù)）/ 酶解前菌落計(jì)數(shù)×100%

2.原生質(zhì)體再生率測(cè)定 :

 將制備的原生質(zhì)體稀釋到2-3×10⁷個(gè)/ml,各取1ml原生質(zhì)體液用PB液稀釋后涂布在高滲*培養(yǎng)基（YEPDS）和*培養(yǎng)基（YEPD）.30℃培養(yǎng)2天計(jì)算菌落數(shù),酶解前的菌液直接用無(wú)菌水稀釋涂布*培養(yǎng)基,，培養(yǎng)后計(jì)算菌數(shù)。

原生質(zhì)體再生率％＝

3.原生質(zhì)體的融合:

（1）. 將L-酵母的原生質(zhì)體用紫外線滅活2分鐘,在黑暗中保存20分鐘, 2500rad/min離心10min,用2ml高緩沖液懸浮.

（2）. 將兩菌的原生質(zhì)體懸浮液混合,離心,向沉淀中加入3mlPEG-CaCl₂,振蕩均勻, 30℃處理20min, 鏡檢并觀察融合情況.

（3）. 用高深緩沖液洗滌菌體沉淀, 2500rad/min離心10min.

（4）. 立即用高深緩沖液稀釋,取融合原菌液及10^-1稀釋液各0.1ml菌液,涂布于再生培養(yǎng)基平板上.

4.融合子的檢出:

 將融合液涂布在加有0.01%的放線菌酮和青霉素（100IU/ml）的再生培養(yǎng)基上,30℃進(jìn)行培養(yǎng)2天,計(jì)算融合率.   

融合率= ×100%

五,、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.融合子的鑒定 : 觀察比較兩親株和融合子的細(xì)胞形態(tài)

2..計(jì)算兩親本原生質(zhì)體的形成率和再生率

3.計(jì)算融合率