WM266-4（人黑色素瘤細(xì)胞）

二,、細(xì)胞接收后的處理

1) 收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于室溫放置約1h,，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們,。

2) 請?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。

3) 貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在室溫中放置1h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況,，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況,。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的培養(yǎng)基6-8mL,，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理,。傳代過程中,，若因運(yùn)輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4) 細(xì)胞運(yùn)輸途中脫落操作方法：把脫落的細(xì)胞收集離心后棄上清,，用PBS清洗一遍,，離心棄上清，在離心管中加入1ml胰酶吹散消化20秒左右,，加養(yǎng)基終止消化后離心重新鋪平,，剩下的貼壁細(xì)胞就按照正常貼壁細(xì)胞傳代方法操作。

5) 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

三,、細(xì)胞培養(yǎng)操作

1) 復(fù)蘇細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考,，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000 rpm條件下離心3 min,，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中,，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）,。第三天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2) 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

a) 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。          

b) 加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，使消化液浸潤所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 -3min（視細(xì)胞消化情況而定）,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml培養(yǎng)基終止消化,。

c) 輕輕打勻后裝入無菌離心管中,，1000 rpm離心5 min,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。          

d) 將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

貼壁細(xì)胞傳代注意點(diǎn)：

一定要PBS洗一遍。

 細(xì)胞多觀察幾次掌握時(shí)間,，不要在細(xì)胞沒有基本脫落就終止消化然后吹打下來,，這樣細(xì)胞  更容易分化和死亡。

不要一直對細(xì)胞吹打

3) 細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。下面 T25 瓶為例；

a) 收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,，裝入無菌離心管中,，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液,，用PBS清洗一遍,，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。

b) 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液,，使細(xì)胞密度1×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻,，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液,，注意凍存管做好標(biāo)識。

c) 將凍存管放入-80℃冰箱,，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存,。記錄凍存管位置以便下次拿取。

四,、培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1) 細(xì)胞出現(xiàn)問題,，予以重發(fā)情況

a) 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問題，細(xì)胞丟失,、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等，重發(fā),；

b) 細(xì)胞污染問題,，請?jiān)谑盏疆a(chǎn)品3 天內(nèi)，給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，核實(shí)后重發(fā),；

c) 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置2小時(shí)后，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后2 天后,，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,，（需提供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片）,，重發(fā)；

d) 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后2天后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置2 小時(shí)候并且未開封,，出現(xiàn)污染,，重發(fā)；

e) 細(xì)胞活性問題,，請?jiān)谑盏疆a(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，用臺盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力，和每天的細(xì)胞照片,，核實(shí)后予重發(fā),；

f) 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3 天請拍照，3 天未告知的,，視為產(chǎn)品合格,。4-7 天內(nèi)出現(xiàn)問題需提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題的照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟，并跟技術(shù)人員溝通的,，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,，重發(fā)。 

2) 細(xì)胞出現(xiàn)問題,，不予以重發(fā)的情況

a) 客戶操作造成細(xì)胞污染,，不重發(fā)；

b) 客戶嚴(yán)重操作失誤致細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā),；

c) 非我們推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā),；

d) 細(xì)胞狀態(tài)不好,，未提供真實(shí)清晰的培養(yǎng)前3 天的細(xì)胞狀態(tài)照片，不重發(fā),；

e) 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題的,，不重發(fā)；

f) 收到細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)問題與客服人員溝通的時(shí)間證明大于7 天的,，不重發(fā),；

g) 視具體情況而定

五、注意事項(xiàng)

1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套,、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮,。解凍時(shí),，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害,。

該細(xì)胞僅供科研使用！說明書僅供參考以實(shí)際到貨說明書為準(zhǔn),！

僅用于科研,，不能用于臨床診斷！所有產(chǎn)品僅供科研使用,，不得用于人或動物的治療等任何其他用途,，不為任何個(gè)人提供產(chǎn)品和服務(wù)。以實(shí)際收貨產(chǎn)品說明書為準(zhǔn),，網(wǎng)站說明書僅供參考,。