1.什么是感受態(tài)細胞

（1）感受態(tài)細胞其實是一種暫時性改變一下細胞膜的通透性,，以利于外源DNA（如質粒）進入細胞,。這樣的活細胞稱為感受態(tài)細胞。

（2）主要原理其實就是通過特殊的方法處理使細胞,，使細胞膜的通透性變大,，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞,，便于外源DNA（如重組質粒或者運載體）進入感受態(tài)的細胞,。

2.
感受態(tài)細胞制備原理在基因克隆技術中,，轉化特指將質粒DNA或以其為載體構建的重組DNA導入細菌體內，使之獲得新的遺傳特性的一種方法,。它是微生物遺傳,、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術之一,。受體細胞經過一些特殊方法(如:電擊法,，CaC12等化學試劑法)處理后，使細胞膜的通透性發(fā)生變化,，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細胞,。進入細胞的DNA分子通過復制、表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀,。

常見的感受態(tài)細胞的制備方法一般有：化學制備法和物理制備法

3.化學制備法大腸桿菌的轉化常用化學法(CaCl2法),，該法先是由Cohen于1972年發(fā)現的。其原理是細菌ACaC12的低滲溶液中,，菌細胞膨脹成球形,，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理,，促使細胞吸收DNA復合物,在豐富培養(yǎng)基上生長數小時后,，球狀細胞復原并分裂增值，被轉化的細菌中,重組子中基因得到表達,，在選擇性培養(yǎng)基平板上,，可選出所需的轉化子。
Ca2+處理的感受態(tài)細胞,，其轉化率一般能達到

5×106~2×107轉化子/ug質粒DNA,，可以滿足一般的基因克隆試驗。如在Ca2+的基礎上,，聯合其它的二價金屬離子(Mn2+,、Co2+)、DMSO或還原劑等物質處理細菌,，則可使轉化率提高100~1000倍,。

化學法簡單、快速,、穩(wěn)定,、重復性好，菌株適用范圍廣,，感受態(tài)細菌可以在-70C保存,，因此被廣泛用于外源基因的轉化。

4.物理制備法電轉法（原理待續(xù)除化學法轉化細菌外,，還有電擊轉化法,，電擊法不需要預先誘導細菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊,，促使DNA進入細菌,，轉化率最高能達到109~1010轉化子/ug閉環(huán)DNA。因操作簡便,，愈來愈為人們所接受）5.感受態(tài)細胞制備具體步驟1. 從 37 ℃ 培養(yǎng) 16～20 h 的平板中挑取一個單菌落（直徑 2～3 mm）,，轉到一個含有 100 ml LB 或 SOB 培養(yǎng)基的 1L 燒瓶中。于 37℃ 劇烈振搖培養(yǎng) 3 h,。一般經驗,，1 OD600 約含有大腸桿菌 DH5α 109個/mL,。

2. 將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的,、用冰預冷的 50 ml 聚丙烯管中,，在冰上放置 10 min，使培養(yǎng)物冷卻至 0℃,。

3. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 特頭（或與之相當的轉頭）以 4 100 r/min 離心 10 min,，以回收細胞。

4. 倒出培養(yǎng)液,，將管倒置 1 min 以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡,。

5. 每 50 ml 初始培養(yǎng)液用 30 ml 預冷的 0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2）重懸每份細胞沉淀,。

6. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 轉頭（或與之相當的轉頭）以 4 100 r/min 離心 10 min,，以回收細胞。

7. 倒出培養(yǎng)液,，將管倒置 1 min 以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡,。

8. 每 50 ml 初始培養(yǎng)物用 2 ml 用冰預冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB） 重懸每份細胞沉淀。

9. 此時,，可以用新鮮制備的感受態(tài)細胞直接做轉化實驗,，也可以將細胞凍存于- 70 ℃。

6.感受態(tài)細胞制備及轉化的影響因素（1）,、細胞的生長狀態(tài)和密度

最好從-70℃或-20°C甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液,。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液,。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數在5×107個左右為佳,。即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制,。對TG1菌株,，OD600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右,。(應注意OD600值與細胞數之間的關系隨菌株的不同而不同),。密度過高或不足均會使轉化率下降。

此外,，受體細胞一般應是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株,。并且受體細胞還應與所轉化的載體性質相匹配,。

(2)、質粒DNA的質量和濃度

用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態(tài)的,，轉化率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,，則會使轉化率下降。一般地,，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%,，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達到飽和。

對于以質粒為載體的重組分子而言,，分子量大的轉化效率低,，實驗證明，大于30kb的重組質粒將很難進行轉化,。此外,，重組DNA分子的構型與轉化效率也密切相關，環(huán)狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍,，因此重組DNA大都構成環(huán)狀雙螺旋分子,。

(3)、試劑的質量

所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的,，并用最純凈的水配制,，最好分裝保存于4°C。

(4),、防止雜菌和雜DNA的污染

整個操作過程均應在無菌條件下進行,，所用器皿，如離心管,，移液槍頭等最好是新的,，并經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌,，且注意防止被其它試劑,、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入,。

(5),、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴,，否則細胞轉化率將會降低,。