尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

UDPG 焦磷酸化酶是生物體糖原合成過程中的關(guān)鍵酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將 1-磷酸葡萄糖與UTP 分子合成為UDP-葡萄糖（UDPG）,。

測(cè)定原理：

UGP 可逆催化反應(yīng)生成 1 磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將 NADP轉(zhuǎn)化為NADPH,，340nm 的吸光值增加速率反映了UGP 活性,。

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶試劑盒 糖原

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存,。臨用前加 5mL 蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑三：粉劑×1 瓶,，-20℃避光保存。臨用前加 5 mL 蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 瓶,，-20℃避光保存,。臨用前加 5 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

天平,、低溫離心機(jī),、研缽、紫外分光光度計(jì),、1 ml 石英比色皿,。

酶液提取：

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g,，加入 1ml 提取液）加入提取液,，冰浴勻漿后于 4℃,，10000g 離心 10min，取上清置冰上待測(cè),。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒,，間隔 7 秒,，總時(shí)間 3min）；然后 4℃,，10000g離心 10min,，取上清置冰上待測(cè)。

3. 液體：直接檢測(cè),。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 取 1ml 石英比色皿,，依次加入 500μl 試劑一，100μl 試劑二,，100μl 試劑三,，100μl 試劑四，100μl 試劑五,，100μl 粗酶液,，充分混勻，記錄 340nm 處 30s 的吸光值A1 和 330s 的吸光值A2,，△A=A2-A1

計(jì)算公式：

（1） 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADP 定義為一個(gè)酶活力單位,。

UGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA÷（ε×d）×V 反總×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA÷（ε×d）×V 反總×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADP 定義為一個(gè)酶活力單位,。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= [ΔA÷（ε×d）×V 反總×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.643×ΔA

（4） 按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADP 定義為一個(gè)酶活力單位,。

UGP（nmol/min/ml）＝[ΔA÷（ε×d）×V 反總×10⁹]÷V 樣÷T=321.54×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,， 1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.1ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g ,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬,。

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