糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b,，GPb）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase,，GP,，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶,，使糖原分子從非還原端逐個(gè)斷開(kāi)α-1,，4-糖苷鍵移去葡萄糖基,，釋放 1-磷酸葡萄糖，直至臨近糖原分子α-1,，6-糖苷鍵分支點(diǎn)前 4 個(gè)葡萄糖基處,。GP 分為有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）和無(wú)活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）兩種形式。GPb 在一定濃度的腺苷酸（5,，-AMP）存在下可被激活,。

測(cè)定原理：

GP 催化糖原和無(wú)機(jī)磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADP 還原生成NADPH,，在 340nm 下測(cè)定NADPH 上升速率,，即可反映 GP 活性。添加一定濃度的腺苷酸（5，-AMP）時(shí)測(cè)定GP（GPa 和GPb）活性,，未添加腺苷酸（5,，-AMP）時(shí)測(cè)定GPa活性，GP 活性－GPa 活性得到GPb 活性,。

糖原磷酸化酶b試劑盒   糖原系列-常備現(xiàn)貨

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì),、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、1ml 石英比色皿,、研缽、冰和蒸餾水,。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm,，蒸餾水調(diào)零；

2,、工作液的配制：臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

3,、試劑三的配制：臨用前在試劑三瓶中加入 2.5ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

4、試劑四的配制：臨用前在試劑四瓶中加入 2.5ml 蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

5,、試劑五的配制：臨用前在試劑五管中加入 1.25ml 蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

6,、將工作液、試劑三、試劑四和試劑五置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘,；

7,、1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本、50μl 試劑三,、50μl 試劑四,、50μl 蒸餾水和 800μl 工作液，立即混勻,，記錄 340nm 處 5min 后的A1 和 10min 后的吸光值A2,，計(jì)算ΔAGPa=A2-A1。

8,、在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本,、50μl 試劑三、50μl 試劑四,、50μl 試劑五和 800μl 工作液,，立即混勻，記錄 340nm 處 5min 后的A3 和 10min 后的吸光值A4,，計(jì)算ΔAGP=A4-A3,。

注意：由于每個(gè)樣本需要同時(shí)測(cè)一個(gè)GP（GPa 和GPb）活性和一個(gè)GPa 活性，因此本試劑盒 50 管測(cè) 24

個(gè)樣本,。

GPb 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ ΔAGPa)÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1×10^-3 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,， 1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.05 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,。

糖原磷酸化酶b試劑盒   糖原系列-常備現(xiàn)貨