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細(xì)胞色素C氧化酶（COX）ELISA 試劑盒

堿性磷酸酶

系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取,，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類(lèi)很多,，常用者為硝基苯磷酸鹽,，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色,，可溶,，大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中,，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位,。

細(xì)胞色素C氧化酶（COX）ELISA 試劑盒

定量測(cè)定

ELISA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的*,，因此在定量測(cè)定中,，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA,，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的范圍一般較寬,，曲線(xiàn)高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時(shí)常用半對(duì)數(shù)值,，以檢測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo),，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接,，所得曲線(xiàn)一般呈S形,，其頭、尾部曲線(xiàn)趨于平坦,，中央較呈直線(xiàn)的部分是理想的檢測(cè)區(qū)域,。

測(cè)定小分子量物質(zhì)常用競(jìng)爭(zhēng)法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān),。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同,。ELISA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)注意圖中橫坐標(biāo)為對(duì)數(shù)關(guān)系,，這更有利于測(cè)定系統(tǒng)的表達(dá),。

操作程序

1.   分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、標(biāo)準(zhǔn)品孔,、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl,；在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育60分鐘,。

2.   棄去液體,，甩干，每孔加滿(mǎn)稀釋后洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。如此重復(fù)5次,，拍干。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

5.   測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行,。

6.   根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度,。也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算,。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的，其實(shí)際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù),。

親和素是一種糖蛋白,，一分子親和素可以與四個(gè)生物素小分子發(fā)生專(zhuān)一親和作用，類(lèi)似抗原與抗體親和,。它們之間的作用力是目前已知強(qiáng)的非共價(jià)作用,。80年代后，隨著生物素-親合素系統(tǒng)（BAS）作用被發(fā)現(xiàn),，這一親和作用被結(jié)合應(yīng)用到ELISA技術(shù)上,，大大提高了后者反應(yīng)的靈敏性與專(zhuān)一性。生物素很易與蛋白質(zhì)（如抗體等）以共價(jià)鍵結(jié)合,。這樣,，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級(jí)放大作用,，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色,，達(dá)到檢測(cè)未知抗原（或抗體）分子的目的。