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6酮前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)ELISA 試劑盒

競爭法

競爭法可用于測定抗原,，也可用于測定抗體。以測定抗原為例,，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合,，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

⑴將特異抗體與固相載體連接,，形成固相抗體,。洗滌。

⑵待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液,，使之與固相抗體反應(yīng),。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合,。如受檢標(biāo)本中含有抗原,，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會與固相抗體結(jié)合,，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少,。參考管中只加酶標(biāo)抗原,，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)充分的量,。洗滌,。

⑶加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原多,，故顏色深,。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量,。待測管顏色越淡,，表示標(biāo)本中抗原含量越多。一般情況,，是通過方波伏安法,，檢測培養(yǎng)體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關(guān)系來終確定體系的終檢測目標(biāo)的濃度,。

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體,。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合,。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng),。如抗原為高純度的，可直接包被固相,。如抗原中會有干擾物質(zhì),，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法,，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體,，然后加入抗原，形成固相抗原,。洗滌除去抗原中的雜質(zhì),，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式,，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合,，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合,，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng),。抗HBe的檢測一般采用此法,。

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定量測定

ELISA操作步驟復(fù)雜,，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個體之間的*,，因此在定量測定中,，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA,，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬,，曲線高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)值,，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo),，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點連接,，所得曲線一般呈S形,，其頭、尾部曲線趨于平坦,，中央較呈直線的部分是理想的檢測區(qū)域,。

測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān),。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同,。ELISA測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線注意圖中橫坐標(biāo)為對數(shù)關(guān)系，這更有利于測定系統(tǒng)的表達(dá),。

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操作程序

1.   分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)品孔,、待測樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl；在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外,。輕輕晃動混勻,，37℃溫育60分鐘。

2.   棄去液體,，甩干,，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。如此重復(fù)5次，拍干,。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標(biāo)板,，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

5.   測定：以空白孔調(diào)零,，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

6.   根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算,。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù),。