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甲狀旁腺素（PTH）ELISA 試劑盒

應(yīng)用于ELISA

親和素是一種糖蛋白,，可由蛋清中提取,。分子量60kD,，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合,。維生素H,，分子量244.31，存在于蛋黃中,。用化學(xué)方法制成的衍生物,，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì),、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物,。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng),，但特異性強(qiáng),，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定,。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置,，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體,。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來(lái),，就可大提高ELISA的敏感度。

親和素－生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式,，可用于間接包被,，亦可用于終反應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A(yù)包被親和素,，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合,，通過(guò)親和素－生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露,。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代,，然后連接親和素－酶結(jié)合物,，以放大反應(yīng)信號(hào)。

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定性測(cè)定
　　　定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出"有"或"無(wú)"的簡(jiǎn)單回答,，分別用"陽(yáng)性",、"陰性"表示。"陽(yáng)性"表示該標(biāo)本在該測(cè)定系統(tǒng)中有反應(yīng),。"陰性"則為無(wú)反應(yīng),。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果,，即用滴度來(lái)表示反應(yīng)的強(qiáng)度,，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。在這種半定量測(cè)定中,，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn),，呈陽(yáng)性反應(yīng)的高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低,，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱,，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義,。

在間接法和夾心法ELISA中,，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反,，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔,。

操作程序

1.   分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、標(biāo)準(zhǔn)品孔,、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl,；在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育60分鐘,。

2.   棄去液體,，甩干,，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次,，拍干,。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

5.   測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

6.   根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度,。也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算,。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的，其實(shí)際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù),。