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基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-8）ELISA 試劑盒

⒈　正式試驗時,，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性,。有時本底較高,，說明有非特異性反應,，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉,。

⒉　在ELISA中,，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：

⑴　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯,、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板,、試管、珠粒等,。當前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板,。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被,，在同一實驗條件下進行反應,，觀察其顯色反應是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。

⑵ 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時,，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間,。吸附溫度,，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時,。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1,、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時,，觀察陽性標本的OD值,。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml,。

⑶　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）,。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度,。

⑷　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉,、安全、有明顯地顯色反應,，而本身無色,。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護,。有條件者應使用不致癌,、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是當前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,，應加入強酸或強堿以終止反應,。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜,。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-8）ELISA 試劑盒

間接法

間接法常用于檢測抗體,，一般的操作步驟為：

1. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上,，完成后洗去多余的抗原。

2. 加入待測檢體,，檢體中若含有待測的一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結(jié),。

3. 洗去多余待測檢體,，加入帶有酶的二次抗體，與待測的一次抗體鍵結(jié),。

4. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值）,，以評估有色終產(chǎn)物的含量即可測量待測抗體的含量,。

操作程序

1.   分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）,、標準品孔,、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入標準品50μl,；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外,。輕輕晃動混勻，37℃溫育60分鐘,。

2.   棄去液體,，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。如此重復5次,，拍干,。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標板，每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

5.   測定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。

6.   根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度,。也可以使用各種應用軟件來計算,。應記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應該乘以總稀釋倍數(shù),。