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脂聯(lián)素（ADP）ELISA 試劑盒

需要而未提供的試劑和器材

1.   37℃恒溫箱,。

2.   標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀,。

3.   精密移液器及一次性吸頭

4.   蒸餾水，

5.   一次性試管

6.   吸水紙

脂聯(lián)素（ADP）ELISA 試劑盒

雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法,，操作步驟如下：

雙抗體夾心法

一,、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),。

二,、加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,，形成固相抗原復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

三,、加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān),。

四、加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量,。

根據(jù)同樣原理,，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,，即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體,。

在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,，例如HBsAg,、HBeAg,、AFP,、hCG等,。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法,。如抗體的來(lái)源為抗血清,，包被和酶標(biāo)用的抗體好分別取自不同種屬的動(dòng)物,。如應(yīng)用單克隆抗體,，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),，作一步法檢測(cè)。

在一步法測(cè)定中,，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復(fù)合物",。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象,，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測(cè)讀,，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落,。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg,、AFP和尿液hCG等）時(shí),，應(yīng)注意可測(cè)范圍的高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng),。

假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇,，也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物,。但在HBsAg的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問(wèn)題，HBsAg有adr,、adw,、ayr、ayw4個(gè)亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題,。

雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體,，多為IgM型,，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng),。采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段,，從而可消除RF的干擾,。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)（參見(jiàn)6.2）,。

夾心法

夾心法常用于檢測(cè)大分子抗原,，一般的操作步驟為:

1. 將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體

2. 加入待測(cè)檢體,，檢體中若含有待測(cè)的抗原,，則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)

3. 洗去多余待測(cè)檢體，加入另一種對(duì)抗原專一的一次抗體,，與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)

4. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體,，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)

5. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,，加入酶底物使酵素呈色,，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果