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T淋巴細胞亞群CD42 ELISA 試劑盒

雙抗體夾心法

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雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，操作步驟如下：

雙抗體夾心法

一,、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質,。

二,、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,，形成固相抗原復合物,。洗滌除去其他未結合的物質。

三,、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合,。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關,。

四,、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理,，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

在臨床檢驗中,，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,，例如HBsAg、HBeAg,、AFP,、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法,。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物,。如應用單克隆抗體,，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物,。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測,。

在一步法測定中,，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,，而不再形成"夾心復合物",。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同,，如按常法測讀,，所得結果將低于實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）,，因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落,。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果,。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg,、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的高值,。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應,。

假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇,，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物,。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,，HBsAg有adr、adw,、ayr,、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,，這也是用單抗作夾心法應注意的問題,。

雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體,，多為IgM型,，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,，它可充當抗原成份,，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應,。采用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑,，由于去除了Fc段，從而可消除RF的干擾,。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。

雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,，因其不能形成兩位點夾心。

雙抗原夾心法測抗體

反應模式與雙抗體夾心法類似,。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體,。此法中受檢標本不需稀釋,，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法,。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法,。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同,，尋找合適的標記方法,。