Human 殘留DNA片段分析檢測試劑盒 (qPCR-熒光探針法)說明書

貨號：HG-HF001

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒是用于定量檢測各種生物制品的中間品、半成品及成品中 Human 宿主 DNA 殘留片段大小分布的專用試劑盒,。
本試劑盒利用 PCR 熒光探針法原理,，定量檢測樣本中 Human 宿主 DNA 殘留片段大小分布，本試劑盒設(shè)計三種不同的擴增片段（99bp,、200bp,、307bp），用 Human DNA 定量參考品分別對不同的擴增片段制作標(biāo)曲，通過不同大小片段的比值分析樣本中 Human 殘留 DNA 的片段分布情況,。

規(guī)格：

3 × 100 Reactions

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品儲存條件與有限期：

-20℃儲存,，有效期 18 個月。

適用機型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機型使用時,，請注意選擇適配的參比染料 ROX

需要準(zhǔn)備材料：

◆ 1.5mL 或 2mL 無菌低吸附離心管
◆ 離心機
◆ 熒光定量 PCR 儀
◆ 與 PCR 儀適配的 96 孔 qPCR 板或八聯(lián)排管
◆ 震蕩器
◆ 1000μL,，200μL，10μL 無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 各規(guī)格移液器（如 1000μL,，200μL,，10μL，2.5μL 等）

操作步驟：

一,、Human DNA 定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA 稀釋液將 Human DNA 定量參考品（濃度為 3ng/μL）進行梯度稀釋,，稀釋濃度依次為 3 × 10⁵fg/μL、3 × 10⁴fg/μL,、3 ×10³fg/μL、 3 ×10²fg/μL,，3 × 10¹ fg/μL,。具體操作如下：
1. 將試劑盒中 Human DNA 定量參考品和 DNA 稀釋液置于冰上，待完i全融化后,，輕微振蕩混勻,，短暫離心將液體甩至管底。
2. 取 5 支干凈的 1.5mL 離心管,，分別標(biāo)記為 ST1,，ST2，ST3,，ST4,，ST5。
3. 在 ST1,，ST2,，ST3，ST4,，ST5 管中分別加入 180μL DNA 稀釋液,。
4. 按表 2 依次進行 5 次稀釋操作，每次稀釋后確保充分混勻后再進行下一個梯度的稀釋,。如先取 20μL Human DNA 定量參考品加入步驟 3 準(zhǔn)備好的 ST1 管中,，輕微振蕩充分混勻，短暫離心將液體甩至管底,；然后再取 20μL ST1 中的標(biāo)準(zhǔn)品加入步驟 3準(zhǔn)備好的 ST2 管中……依次稀釋,。

表 2. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程

二、陰性質(zhì)控 NCS 及 NTC 的準(zhǔn)備

取 100μL DNA 稀釋液加入 1.5mL 干凈的離心管中,，標(biāo)記為陰性質(zhì)控 NCS,。
陰性質(zhì)控 NCS 可和同批待測樣本一起進行樣本前處理,，制備成陰性質(zhì)控 NCS 純化液。
qPCR 反應(yīng)加樣時,，加入 10μL DNA 稀釋液即為陰性對照 NTC,。
注：為了滿足同步進行三個不同擴增長度的片段分析檢測需求，樣本前處理中 DNA 洗脫體積需要≥ 100μL,。

三,、加標(biāo)體系制備

加標(biāo)回收 ERC：建議 90uL 樣品 +10uLST3，也可根據(jù)實際情況按照其他方式制備,。
加標(biāo)回收率計算：ERC 回收率在 50%~150% 之間（加標(biāo)回收率 =ERC/(0.9* 樣品 +0.1*ST3）

四,、qPCR 反應(yīng)液的制備

1. 從冰箱里取出各試劑置于冰上。
2. 根據(jù)所要檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣本數(shù)量,，計算所需反應(yīng)孔數(shù),，一般做 3 個重復(fù)孔 / 樣。即反應(yīng)孔數(shù) =（5 個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線 + 1 個無模板對照 NTC+ 1 個陰性質(zhì)控 NCS + 待測樣本數(shù)量）×3,。
3. 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算本次所需的 qPCR 反應(yīng)液總量： qPCR 反應(yīng)液 =（反應(yīng)孔數(shù) +2）× 20μL（含有 2 孔的損失量）,。
4. 待各試劑放在冰上充分融化后，參考表 3,、4,、5 所示并組合反應(yīng)孔數(shù)準(zhǔn)備對應(yīng)擴增片段的 qPCR 反應(yīng)液，并充分混勻,。

表 3. 99bp qPCR 反應(yīng)液配制表

表 4. 200bp qPCR 反應(yīng)液配制表

表 5. 307bp qPCR 反應(yīng)液配制表

* 請對應(yīng)機型選擇適配的 ROX,；若機型適配為 no ROX，請加入等體積的去離子水（要求無核酸及核酸酶污染級去離子水）,。

五,、上樣

1. 將配制的各 qPCR 反應(yīng)液輕微振蕩混勻，短暫離心將液體甩至管底,。按 20μL/ 孔加入排版設(shè)計（如表 9 示例或按個人設(shè)計調(diào)整）對應(yīng)的孔中,，選擇對應(yīng)擴增片段參考表 6、7,、8 所示加樣,，加樣后每孔總體積 30μL。

表 6. 99bp 各反應(yīng)孔加樣示例

表 7. 200bp 各反應(yīng)孔加樣示例

表 8. 307bp 各反應(yīng)孔加樣示例

表 9 96 孔板排版示例

& 該示例表示的是檢測 5 個濃度梯度的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線,、1 個無模板對 NTC,、1 個陰性質(zhì)控 NCS、3 個待測樣本,。每個檢測做 3 個重復(fù)孔,。也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣進行設(shè)計排版。

2. 將 96 孔板用光學(xué)膜封閉，輕微震蕩混勻,，用 96 孔板專用離心機短暫離心裝液體全部甩至管底后放入 qPCR 儀中,。

六、上機

以 ABI 公司 7500 qPCR 儀,，軟件版本 V2.0.6 為例,。
1. 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板,，taqman 探針法,。
2. 三組 qPCR 反應(yīng)液創(chuàng)建新檢測探針，分別命名為 99bp,、200bp,、307bp，選擇報告熒光基團為 FAM,，猝滅熒光基團為 none,；創(chuàng)建新檢測探針，命名為 IPC,，選擇報告熒光基團為 VIC,，猝滅熒光基團為 none，檢測參比熒光為 ROX,。
3. 將板上標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的孔選擇為 Standard,，分別賦值為 3 x 10⁵,、3 x 10⁴,、3 x 10³、 3 x 10²,，3 x 10¹ （單位為 fg/μL）,，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2,、ST3,、ST4、ST5,；NTC 選擇 Negative Control,，NCS 和待測樣品孔選擇為 Unknow，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 NTC,、NCS,、S1、S2,、S3,。
4. 設(shè)置三步法反應(yīng)程序：95℃ 5min；95℃ 15s，58℃ 30s,，72℃ 1 min,，45 個循環(huán)；反應(yīng)體積 30μL,。
5. 運行 PCR 程序,。

七、qPCR 結(jié)果分析

1. 在 Results 的 Amplification Plot 中,，可初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常,。機器通常會自動設(shè)置閾值（Threshold）和基線（Baseline），當(dāng) target 設(shè)置等不同時可能會出現(xiàn)多個閾值,，而導(dǎo)致結(jié)果分析有誤,，此時請手動設(shè)置閾值線，但需確保設(shè)置的閾值線在指數(shù)擴增區(qū),，如通常 Threshold 設(shè)置為 0.15,，選擇 Auto Baseline，點擊 Analyze,，可看到調(diào)整后的結(jié)果,。
2. 數(shù)據(jù)可靠性分析：
• 三個平行孔間 Ct 值差應(yīng)小于 1.0，Ct 值大于 35 的孔除外,；
• 陰性對照 NTC 和 NCS 的 CT 值都應(yīng)大于標(biāo)曲最i低濃度的 CT 值或根據(jù)實驗室自身驗證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn),；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù) R2 ≥ 0.98，擴增效率 85%~110% 之間,；
• ERC 回收率在 50%~150% 之間,；
3. 以 99bp 片段的待測樣本檢測值為 100%，計算 200bp 片段,、307bp 片段的待測樣本百分比,。