K562 feeder cell  殘留檢測試劑盒說明書

貨號： HG-KF001

產(chǎn)品簡介：

基因編輯的K562 細(xì)胞因其良好的促進(jìn)增殖作用而被廣泛研究和使用,。研究表明使用基因編輯的K562 細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞能使NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率提高幾十到上萬倍,。在最近的FDA發(fā)布的指南文件《Considerations for the Use of Human- and AnimalDerived Materials in the Manufacture of Cellular and Gene Therapy and Tissue-Engineered Medical Products》和藥監(jiān)局發(fā)布的《淺析細(xì)胞治療產(chǎn)品中滋養(yǎng)細(xì)胞的使用及控制策略》指南文件中，均提及可以使用經(jīng)過輻照后的K562細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞,，用于體外培養(yǎng)使用,。
盡管K562細(xì)胞經(jīng)過輻照處理，且易被生長的NK 細(xì)胞殺死,，但仍需確保細(xì)胞終產(chǎn)品中盡可能沒有滋養(yǎng)細(xì)胞殘留,，以保障患者安全。建議研究人員開發(fā)靈敏度高的檢測方法,，例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測法,、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（ddPCR）檢測法等，并對檢測方法進(jìn)行專屬性,、準(zhǔn)確性,、精密度、檢測限等驗(yàn)證,，以保證檢測方法能對生產(chǎn)過程及終產(chǎn)品進(jìn)行有效表征,，減少對產(chǎn)品質(zhì)量,、臨床療效及安全性的影響。
本試劑盒使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測法,，設(shè)計(jì)特異性的靶標(biāo)位點(diǎn),，進(jìn)行K562 feeder cell 殘留檢測。
本試劑盒的檢測范圍：10 copies/μL~ 1×10⁶ copies/μL,，K562細(xì)胞的最i低檢測限度為0.05%,。

應(yīng)用：

細(xì)胞制劑樣本中K562 feeder cell殘留檢測。

規(guī)格：

100 Reactions

產(chǎn)品組成：

存儲條件及有效期

-18℃及以下儲存,，有效期 18 個月

適用機(jī)型（包括但不限于）

◆?ABI PRISM 7500 

 ◆?FQD-96A（博日） 

 ◆?CFX96(Bio-Rad) 

 ◆?Roche Light Cycler 480

• 需自行準(zhǔn)備的材料

(1) 熒光定量PCR儀器（包括FAM和VIC熒光通道）

(2) 渦旋振蕩器

(3) 掌上離心機(jī)

(4) RNA 提取試劑     

(5) 逆轉(zhuǎn)錄檢測試劑

(6) 移液器及吸頭     

(7) 八聯(lián)排管加蓋或96孔半裙邊板加封口膜

實(shí)驗(yàn)步驟

1.?RNA 提取

取一定量的細(xì)胞懸液（1E6-5E6細(xì)胞）進(jìn)行RNA提取

2.?逆轉(zhuǎn)錄

對提取的細(xì)胞RNA進(jìn)行基因組DNA去除和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得檢測使用的cDNA,。

3.?PCR 擴(kuò)增

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：

取出定量標(biāo)準(zhǔn)品和DNA稀釋液,，置于4℃冰箱中融化；待融化完i全后,，上下顛倒混勻20次后,，在復(fù)合轉(zhuǎn)子離心機(jī)中6000 rpm 離心5秒，用DNA 稀釋液將RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品(1E+08 copies/μL)梯度稀釋至1E+06 copies/μL,、1E+05 copies/μL,、1E+04 copies/μL、1E+03 copies/μL,，1E+02 copies/μL,，10 copies/μL。具體操作如下：取 7 支 1.5 mL 離心管,，分別標(biāo)記為STD0,，STD1，STD2,，STD3,，STD4，STD5,，STD6,，參考下表進(jìn)行稀釋操作（每一步稀釋都需充分震蕩混勻）：

3.2 PCR反應(yīng)液配置
根據(jù)樣本檢測數(shù)量計(jì)算需要的反應(yīng)孔數(shù)，每個樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測,。備注：根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液 =（反應(yīng)孔數(shù)+2）× 15 μL（含有2孔的損失量）,。在生物安全柜內(nèi)配制PCR混合液，配置情況如表所示：

備注：如果儀器不需要加ROX，可以將50x ROX 替換為無酶水,。
各個反應(yīng)孔加樣情況如表所示：

3.3 加完樣后,，將8聯(lián)排蓋子蓋上，先蓋上兩頭的蓋子,，再蓋上中間的蓋子,，并在蓋子邊 緣做好標(biāo)記。
3.4 加樣完成密封好管子后,，先在復(fù)合轉(zhuǎn)子離心機(jī)中6000 rpm離心10秒將管壁的液體離心收集至管底,，再置于調(diào)節(jié)至6檔的旋渦混合器上震蕩10秒以上，完i全混勻反應(yīng)液,，再在復(fù)合轉(zhuǎn)子離心機(jī)中6000 rpm離心10秒將管壁的液體離心收集至管底,，如有氣泡，需將氣泡排盡,。
3.5 PCR程序設(shè)置
打開PCR儀,，設(shè)置PCR反應(yīng)程序：

3.6 設(shè)置樣品反應(yīng)板：按照PCR反應(yīng)液加樣位置編輯標(biāo)準(zhǔn)品、NTC,、Neg,、ERC、待測樣本的信息,。在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔,，在Sample Type中下拉選擇Unknow,，勾選熒光FAM，Target Name命名為K562,，勾選熒光VIC,，Target Name命名ABL，輸入每個樣品的重復(fù)次數(shù)及Sample Name,。輸入每個稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及Sample Name,。并且分別在STD1，STD2,，STD3,，STD4，STD5,，STD6的Concentration一欄賦值為1E+06,、1E+05、1E+04,、1E+03,、1E+02、1E+01，選擇單位（copies/μL）,。
3.7 開啟加熱蓋,，按照樣品板編輯信息放置八聯(lián)管，關(guān)閉加熱蓋,，啟動PCR運(yùn)行程序,，開始PCR反應(yīng)。

4.?數(shù)據(jù)處理

4.1 反應(yīng)結(jié)束后,，儀器會自動設(shè)置基線和閾值,。保存并導(dǎo)出結(jié)果。
4.2 利用excel計(jì)算結(jié)果:將儀器直接導(dǎo)出的檢測結(jié)果帶入預(yù)先設(shè)計(jì)好的檢測結(jié)果分析表格中,，進(jìn)行最終的檢測結(jié)果計(jì)算,，并將計(jì)算的excel表格附件到檢測記錄中。
4.3 計(jì)算公式K562 feeder cell 殘留比例 =K562 檢測結(jié)果/ABL 檢測結(jié)果*100%

5.?系統(tǒng)適用性判定

5.1 三個平行孔間的Ct值變異系數(shù)CV%≤5%,，Ct值大于35的孔除外,。
5.2 空白 NTC 應(yīng)無Ct值或大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最i低濃度2個Ct值。
5.3 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增效率Effective：85.0%~110.0%,，R2≥0.990,。

6.?符號及縮寫

6.1 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard Products)：STD；
6.2 無模板對照：NTC,；
6.3 供試品（Sample）：S,。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無需分裝,。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域,，不可在一個區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊,，戴 好口罩,、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭,，避免交叉污染,，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用,。
5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用,。
6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證最佳檢測效果,。
7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù) qPCR 檢測,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性,、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),。
9. 公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé),，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量,， 預(yù)留充足的樣本,。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷,。

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