白介素8受體（可溶性）ELISA KIT

白介素8受體（可溶性）ELISA KIT介紹

白介素 8（IL-8）,，又稱(chēng)趨化因子 CXCL8，是一種由單核 - 巨噬細(xì)胞,、上皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子,，分子量約 8kd。多種細(xì)胞在 LPS,、TNF 或 IL-1 刺激下均可產(chǎn)生 IL-8 ,。IL-8 通過(guò)結(jié)合趨化因子受體白細(xì)胞介素 - 8 受體 α（IL8-Rα，CXCR1）和白細(xì)胞介素 - 8 受體 β（IL-8Rβ,，CXCR2）,，對(duì)中性粒細(xì)胞發(fā)揮趨化和激活作用,，參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng) ,。在自身免疫性疾病,、慢性炎癥性疾病等病癥中，IL-8 產(chǎn)生異常,，因此定量檢測(cè) IL-8 對(duì)于研究疾病發(fā)生發(fā)展及指導(dǎo)治療意義重大 ,。而白介素 8 受體（可溶性）ELISA KIT 正是用于精準(zhǔn)檢測(cè)相關(guān)樣本中可溶性白介素 8 受體含量的工具 。

一,、檢測(cè)原理

二,、試劑盒組成

1. 酶聯(lián)板：已預(yù)包被抗人白介素 8 受體（可溶性）抗體,，一般為 96 孔或 48 孔，用于承載樣本和試劑反應(yīng) ,。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：通常為凍干品，有 2 瓶 ,。臨用前需用樣品稀釋液溶解并稀釋至特定濃度（如高濃度標(biāo)準(zhǔn)品可能為 1600pg/mL）,，再進(jìn)行系列倍比稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛忍荻鹊臉?biāo)準(zhǔn)品溶液,，如 800pg/mL、400pg/mL,、200pg/mL,、100pg/mL、50pg/mL,、25pg/mL 等,，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。

3. 樣品稀釋液：用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及稀釋濃度過(guò)高的待測(cè)樣本,，一般為 1×20mL 裝 ,。

4. 生wu素標(biāo)記抗體：與可溶性白介素 8 受體特異性結(jié)合，為濃縮液,，使用時(shí)需用生wu素標(biāo)記抗體稀釋液按比例稀釋?zhuān)话銥?1×120μL / 瓶（1：100） ,。

5. 生wu素標(biāo)記抗體稀釋液：1×10mL 裝，用于稀釋生wu素標(biāo)記抗體 ,。

6. HRP 偶聯(lián)的親和素：與生wu素標(biāo)記抗體結(jié)合,，形成完整的檢測(cè)體系，為濃縮液,，使用時(shí)需用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液按比例稀釋?zhuān)话銥?1×120μL / 瓶（1：100） ,。

7. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液：1×10mL 裝，用于稀釋 HRP 偶聯(lián)的親和素 ,。

8. 底物溶液（TMB）：1×10mL 裝,，與 HRP 發(fā)生顯色反應(yīng)，在 HRP 催化下 TMB 由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色 ,。

9. 濃洗滌液：1×20mL 裝,，使用時(shí)需用蒸餾水或去離子水按一定比例（如 1：25）稀釋?zhuān)糜谙礈烀嘎?lián)板，去除未結(jié)合的物質(zhì),，降低背景干擾 ,。

10. 終止液：1×10mL 裝，一般為 2N 的硫酸溶液,，用于終止顯色反應(yīng),，使藍(lán)色反應(yīng)液轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。

11. 覆膜：多為 5 張,，用于在溫育過(guò)程中覆蓋酶聯(lián)板,，防止液體蒸發(fā)和外界污染 。

12. 使用說(shuō)明書(shū)：1 份,，詳細(xì)介紹試劑盒的使用方法,、注意事項(xiàng)、性能指標(biāo)等 。

三,、樣本要求

1. 血清：采集全血后,，室溫放置 2 小時(shí)或 4°C 過(guò)夜，隨后以 1000×g 離心 20 分鐘,，小心吸取上清液用于檢測(cè) ,。收集血液應(yīng)使用一次性無(wú)熱原、無(wú)內(nèi)毒素的試管 ,。

2. 血漿：可選用乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素作為抗凝劑 ,。標(biāo)本采集后，需在 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8°C 以 1000×g 離心 15 分鐘,，取上清備用 ,。

3. 組織勻漿：先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01M,，pH = 7.4）沖洗組織,，che底去除殘留血液（因勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)干擾測(cè)量） 。稱(chēng)取適量組織并剪碎,，按照約 1：9 的重量體積比（如 1g 組織對(duì)應(yīng) 9mL PBS,，可按需調(diào)整并記錄），將剪碎組織與 PBS 加入玻璃勻漿器,，在冰上充分研磨 ,。為進(jìn)一步裂解細(xì)胞，可對(duì)勻漿液超聲破碎或反復(fù)凍融 ,。最后,，將勻漿液以 5000×g 離心 5 - 10 分鐘，取上清用于檢測(cè) ,。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：將細(xì)胞培養(yǎng)上清以 1000×g 離心 20 分鐘,，去除雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清即可用于檢測(cè) ,。

5. 其他生物標(biāo)本：如腦脊液,、腹水等，一般以 1000×g 離心 20 分鐘,，取上清進(jìn)行檢測(cè) ,。

四、操作流程

1. 準(zhǔn)備工作：從冰箱取出試劑盒,，提前 30 分鐘平衡至室溫,，確保所有試劑溫度與室溫一致 ,。同時(shí),，將濃縮洗滌液按要求比例用蒸餾水或去離子水稀釋備用 。

2. 加樣：設(shè)置空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔 ,。空白孔加入 100μL 樣品稀釋液,；標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 100μL,；待測(cè)樣品孔加入 100μL 待測(cè)樣本 。加樣時(shí),，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻,，避免產(chǎn)生氣泡,，隨后用覆膜蓋住酶聯(lián)板，37°C 溫育 120 分鐘 ,。

3. 洗滌：溫育結(jié)束后,，棄去孔內(nèi)液體，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上,，輕輕拍干 ,。每孔加入 350μL 洗滌液，浸泡 1 - 2 分鐘后,，甩去洗滌液，再次拍干 ,。重復(fù)洗滌步驟 5 次,，確保che底洗去未結(jié)合的物質(zhì) 。

4. 加生wu素標(biāo)記抗體：每孔加入 100μL 稀釋好的生wu素標(biāo)記抗體工作液（臨用前配制）,，覆膜后 37°C 溫育 60 分鐘 ,。

5. 再次洗滌：溫育完成后，按上述洗滌方法再次洗滌酶聯(lián)板 5 次 ,。

6. 加 HRP 偶聯(lián)的親和素：每孔加入 100μL 稀釋好的 HRP 偶聯(lián)的親和素工作液,，覆膜后 37°C 溫育 60 分鐘 。

7. 第三次洗滌：重復(fù)洗滌步驟 5 次 ,。

8. 顯色：每孔加入 90μL 底物溶液（TMB）,，輕輕混勻，37°C 避光顯色 。顯色時(shí)間一般控制在 30 分鐘內(nèi),，期間需密切觀察標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色變化,，當(dāng)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前 3 - 4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3 - 4 孔梯度不明顯時(shí),，即可進(jìn)行下一步 ,。

9. 終止反應(yīng)：每孔加入 50μL 終止液，輕輕混勻,，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 ,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同，且底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液 ,。

10. 讀數(shù)：在加終止液后 15 分鐘內(nèi),，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度（OD 值） 。

11. 計(jì)算結(jié)果：以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),，OD 值為縱坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ?？山柚鷮?zhuān)業(yè)的曲線制作軟件（如 Curve Expert 1.3 或 1.4）,，根據(jù)樣品的 OD 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度，再乘以樣品的稀釋倍數(shù),，即為樣品中白介素 8 受體（可溶性）的實(shí)際濃度 ,。

五、性能指標(biāo)

1. 檢測(cè)范圍：不同試劑盒有所差異,，常見(jiàn)檢測(cè)范圍為 15.6pg/mL - 1000pg/mL 等 ,。

2. 靈敏度：通常可低至能檢測(cè)出 3pg/mL 甚至更低濃度的可溶性白介素 8 受體 ,。

3. 特異性：試劑盒對(duì)白介素 8 受體（可溶性）具有高度特異性,，與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物幾乎無(wú)交叉反應(yīng) 。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)（CV）一般小于 10%,，板間變異系數(shù)小于 15% ,。

5. 準(zhǔn)確性：通過(guò)對(duì)已知濃度的可溶性白介素 8 受體標(biāo)準(zhǔn)品多次檢測(cè)，測(cè)量值與理論值的偏差在合理范圍,，一般回收率在 80% - 120% 之間 ,。

六、注意事項(xiàng)

1. 試劑盒從冰箱取出后需平衡至室溫方可使用,，使用后應(yīng)立即按要求保存試劑,，避免試劑反復(fù)凍融 。

2. 操作過(guò)程中應(yīng)使用一次性吸頭,，防止交叉污染 ,。加樣時(shí),，確保吸頭垂直且深入孔底，避免液體掛壁或產(chǎn)生氣泡 ,。

3. 洗滌是關(guān)鍵步驟,，洗滌不充分易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果 。若使用自動(dòng)洗板機(jī),，需提前熟練掌握其操作方法,，并定期校準(zhǔn) 。

4. 底物溶液對(duì)光敏感,，應(yīng)避光保存,，使用過(guò)程中避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下 。顯色反應(yīng)需在 37°C 避光條件下進(jìn)行,，且嚴(yán)格控制顯色時(shí)間 。

5. 終止液具有腐蝕性,，操作時(shí)應(yīng)小心,，避免接觸皮膚和眼睛 。若不慎接觸,，應(yīng)立即用大量清水沖洗,，并及時(shí)就醫(yī) 。

6. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均做雙份檢測(cè),，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性 ,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，應(yīng)先進(jìn)行稀釋?zhuān)僦匦聹y(cè)定,，計(jì)算結(jié)果時(shí)需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù) ,。

7. 不同批次的試劑盒內(nèi)試劑不能混用，使用前應(yīng)仔細(xì)核對(duì)試劑盒的有效期和批次號(hào) ,。

8. 該試劑盒僅用于科研用途,，不得用于臨床診斷 。