白介素-5 ELISA KIT

白介素-5 ELISA KIT是科研中用于定量檢測(cè)生物樣本里白介素 - 5 含量的關(guān)鍵工具,，為深入探究免疫反應(yīng)、炎癥機(jī)制等提供有力支持,。

1. 檢測(cè)原理：運(yùn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法,。試劑盒的酶聯(lián)板預(yù)先包被了針對(duì) IL-5 的特異性抗體。當(dāng)加入樣本后,，樣本中的 IL-5 與固相抗體特異性結(jié)合,。接著加入酶標(biāo)記的抗 IL-5 抗體，形成 “固相抗體 - IL-5 - 酶標(biāo)抗體” 復(fù)合物,。經(jīng)洗滌去除未結(jié)合物,，加入底物溶液（如 TMB），在酶催化下,，底物發(fā)生顯色反應(yīng),，顏色深淺與樣本中 IL-5 含量成正比。通過(guò)酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度,，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比,，從而計(jì)算出樣本中 IL-5 的濃度 。

2. 試劑盒組成

• 酶聯(lián)板：有 96 孔或 48 孔,，預(yù)包被抗 IL-5 抗體,，是反應(yīng)的載體。

• 標(biāo)準(zhǔn)品：一般為凍干品,，通常有 2 瓶。臨用前需用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶,，并稀釋成不同濃度梯度,，如 0、7.8,、15.6,、31.2、62.5,、125,、250、500 pg/mL 等,，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ,。

• 樣本xi釋液：用于稀釋濃度過(guò)高的待測(cè)樣本，確保樣本濃度在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi),。

• 酶標(biāo)抗體：即 HRP 標(biāo)記的抗 IL-5 抗體,，為濃縮液,，使用時(shí)需按要求用酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋。

• 酶標(biāo)抗體稀釋液：專門用于稀釋酶標(biāo)抗體,。

• 底物溶液：如 TMB 底物,，與酶標(biāo)抗體中的 HRP 反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。

• 洗滌液：多為濃縮液,，使用時(shí)需按比例用蒸餾水或去離子水稀釋,，用于洗滌酶聯(lián)板，去除未結(jié)合物質(zhì),，降低背景干擾,。

• 終止液：一般為強(qiáng)酸溶液（如硫酸），用于終止底物的顯色反應(yīng),，使反應(yīng)液顏色穩(wěn)定,，便于讀數(shù)。

• 封板膜：溫育時(shí)覆蓋酶聯(lián)板,，防止液體蒸發(fā)和外界污染,。

• 使用說(shuō)明書：詳細(xì)介紹試劑盒的使用方法、注意事項(xiàng),、性能指標(biāo)等,。

3. 樣本要求

• 血清：采集血液后，室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜,，1000×g 離心 20 分鐘,，取上清備用。采血應(yīng)使用無(wú)熱原,、無(wú)內(nèi)毒素的一次性器材 ,。

• 血漿：可用乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素等抗凝劑,。樣本采集后 30 分鐘內(nèi),，在 2 - 8℃下 1000×g 離心 15 分鐘，取上清 ,。

• 細(xì)胞培養(yǎng)上清：將細(xì)胞培養(yǎng)上清 1000×g 離心 20 分鐘,，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)后，取上清用于檢測(cè) ,。

• 組織勻漿：用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS,，0.01M，pH = 7.4）沖洗組織,，去除殘留血液,。剪碎組織后，按 1:9（w/v）加入 PBS，在冰上充分研磨,。再經(jīng) 5000×g 離心 5 - 10 分鐘,，取上清用于檢測(cè) 。

• 樣本采集后若短期內(nèi)檢測(cè),，可保存于 4℃,；若需長(zhǎng)時(shí)間保存，需置于 - 20℃或 - 80℃凍存,，且要避免反復(fù)凍融,，溶血樣本一般不適合檢測(cè) 。

4. 操作流程

• 準(zhǔn)備工作：從冰箱取出試劑盒,，提前 30 分鐘平衡至室溫,。同時(shí)，將濃縮洗滌液按要求比例用蒸餾水或去離子水稀釋備用 ,。

• 加樣：設(shè)置空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔?？瞻卓准尤霕颖緓i釋液,，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔加入處理好的樣本,，每孔加樣量通常為 100μL,，輕輕混勻，37℃溫育 90 分鐘 ,。

• 洗滌：溫育結(jié)束后,，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液加滿各孔,，浸泡 1 - 2 分鐘后甩干,，重復(fù)洗滌 5 次，確保che底洗凈未結(jié)合物質(zhì) ,。

• 加酶標(biāo)抗體：每孔加入 100μL 稀釋好的酶標(biāo)抗體工作液,，37℃溫育 60 分鐘 。

• 再次洗滌：重復(fù)上述洗滌步驟 ,。

• 顯色：每孔加入 90μL 底物溶液，輕輕混勻,，37℃避光顯色 15 - 30 分鐘（需根據(jù)實(shí)際顯色情況判斷） ,。

• 終止反應(yīng)：每孔加入 50μL 終止液，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色 ,。

• 讀數(shù)：在加終止液后 15 分鐘內(nèi),，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度（OD 值） 。

• 計(jì)算結(jié)果：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。根據(jù)樣本的 OD 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的濃度，若樣本進(jìn)行了稀釋,，需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),，從而得到實(shí)際濃度 。