人糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)ELISA試劑盒相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究：

糖化血紅蛋白A1（GHbA1）和糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)測(cè)定法及其在糖尿病臨床上應(yīng)用的意義——Ⅱ.糖化血紅蛋白A1c色譜法測(cè)定及其在糖尿病臨床上的應(yīng)用
摘要：糖化血紅蛋白A1（GHbAI）化學(xué)法測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)糖尿病病情控制程度有實(shí)用價(jià)值,。GHbAI中包括GHbIa、AIb,、AIc,、AId、AIc等五部份,以前三者為主要,。GHbAIa+b為血紅蛋白β鏈N末端與糖或糖磷酸鹽結(jié)合而成,。在高血糖病人不一定升高;而GHbAIc為血紅蛋白β鏈N末端以酮胺鍵的形式與葡萄糖連結(jié)。
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液,；
（2）洗滌液,，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水,；
（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）,；
（4）酶的底物；
（5）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中）,，elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）,；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實(shí)驗(yàn)試劑，不得用于臨床診斷,。
檢測(cè)種屬：人,、大小鼠、兔,、羊,、猴、豬,、豚鼠ELISA檢測(cè)試劑盒等種屬,。
標(biāo)本：血清、血漿,、細(xì)胞上清液,、尿液、體液,、灌洗液,、腦脊髓、心房水,、胸房水,、組織等。 
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人糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)ELISA試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿,、組織勻漿,、細(xì)胞裂解液,、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類標(biāo)本：
包括血清,，血漿,，尿液，胸腹水,，腦脊液,，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清，如保存過程中如有沉淀,，請(qǐng)?jiān)俅坞x心,。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清,，如保存過程中有沉淀,，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
尿液：
用無(wú)菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀,，請(qǐng)?jiān)俅坞x心,。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右，通過反復(fù)凍融,，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清,，如保存過程中有沉淀,，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后,，稱取重量,，加入一定量的PBS（PH7.4）,，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆茫瑯?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度,，加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。

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ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度,，包被的溫度和時(shí)間,，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,，在4-8℃冰箱中放置過夜,，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和,?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的,。通常在ELISA板孔中加入包被液后,，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果,。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml,。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程,。抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低,，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙,，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似,。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,，其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉,，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用,，但由于奶粉的成份復(fù)雜,，而且封閉后的載體不易*保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用,。 
封閉是否必要,，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉,，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高,。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法,，只要酶標(biāo)記物是高活性的,，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果,。特別是用單抗腹水直接包被時(shí),，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用,。但在間接法測(cè)定中,，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,，在低溫可保存數(shù)月,。