人胃泌素(Gastrin)ELISA分析檢測試劑盒相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究：

抗人胃泌素單克隆抗體及其單鏈抗體的研制
摘要：建立能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗人胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,在對其親和力,、特異性以及生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上,克隆抗人胃泌素單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建抗人胃泌素單鏈抗體基因,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定,。方法:以胃泌素合成肽與鑰孔戚血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物為免疫原,采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗人胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,大量制備并經(jīng)鹽析,、蛋白G親和層析獲得純化的單克隆抗體,采用SDS-PAGE對抗體進(jìn)行分子量和純度鑒定,間接ELISA法檢測效價(jià),雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)鑒定類和亞類,非競爭酶免疫實(shí)驗(yàn)測定親和力,斑點(diǎn)ELISA和免疫組化鑒定特異性,并且分別采用熒光染色法和MTT比色法,研究其對胃泌素/胃泌素受體結(jié)合的阻斷作用,以及對SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用。在此基礎(chǔ)上,選擇雜交瘤細(xì)胞株E8,用TRIZOL試劑提取總RNA,通過RT-PCR,采用小鼠重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物,擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因,。通過重疊延伸PCR將兩個可變區(qū)基因通過連接肽基因連接起來,構(gòu)建單鏈抗體基因,克隆到pGEM-T載體中,通過酶切,、PCR和測序進(jìn)行鑒定。
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液,；
（2）洗滌液,，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水,；
（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）,；
（4）酶的底物；
（5）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中）,，elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實(shí)驗(yàn)試劑,，不得用于臨床診斷,。
檢測種屬：人、大小鼠,、兔,、羊、猴,、豬,、豚鼠ELISA檢測試劑盒等種屬。
標(biāo)本：血清,、血漿,、細(xì)胞上清液、尿液,、體液,、灌洗液、腦脊髓,、心房水,、胸房水、組織等,。 
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人胃泌素(Gastrin)ELISA分析檢測試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清,、血漿,、組織勻漿,、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量,。

液體類標(biāo)本：
包括血清,，血漿，尿液,，胸腹水,，腦脊液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等,。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清,，如保存過程中如有沉淀,，請?jiān)俅坞x心。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA,，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清,，如保存過程中有沉淀，請?jiān)俅坞x心,。
尿液：
用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清,，如保存過程中有沉淀,，請?jiān)俅坞x心。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,，通過反復(fù)凍融,，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清,，如保存過程中有沉淀，請?jiān)俅坞x心,。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后,，稱取重量,，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度,，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測,，其余冷凍備用,。

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ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度,，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定,?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的,。通常在ELISA板孔中加入包被液后,，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果,。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和,。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的,。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜,，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果,。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定,。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml,。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低,，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙,，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附,。封閉的手續(xù)與包被相類似,。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的,。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,，其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）,。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用,，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易*保存,，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用,。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件,。并非所有的ELISA固相均需封閉,，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。一般說來,，雙抗體夾心法,，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌*,，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果,。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面,，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用,。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的,。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,，在低溫可保存數(shù)月。