人T細(xì)胞受體(TCR)ELISA分析檢測試劑盒相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究：

T細(xì)胞受體(TCR)信號傳遞的調(diào)控及其功能
摘要：T細(xì)胞受體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化在胸腺T細(xì)胞發(fā)育,、T細(xì)胞亞群分化以及效應(yīng)T細(xì)胞功能發(fā)揮過程中均起著至關(guān)重要的作用,。TCR能特異性識別抗原提呈細(xì)胞表面MHC提呈的抗原肽(peptide),并將胞外識別轉(zhuǎn)化成可向細(xì)胞內(nèi)部傳遞的信號,通過誘導(dǎo)TCR鄰近酪氨酸激酶活化,促進(jìn)信號傳遞復(fù)合物組裝,活化下游MAPK、PKC以及鈣離子等信號途徑,終活化相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控效應(yīng)蛋白分子的表達(dá),完成T細(xì)胞的活化,。TCR信號傳遞過程受到不同類型調(diào)控分子的調(diào)控,這些具有調(diào)控功能的分子形成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來精細(xì)調(diào)控TCR信號的起始,、強(qiáng)度及終止。 
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液,；
（2）洗滌液,，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水,；
（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）,；
（4）酶的底物；
（5）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中）,，elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）,；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實(shí)驗(yàn)試劑，不得用于臨床診斷,。
檢測種屬：人,、大小鼠、兔,、羊,、猴、豬,、豚鼠ELISA檢測試劑盒等種屬,。
標(biāo)本：血清、血漿,、細(xì)胞上清液,、尿液、體液,、灌洗液,、腦脊髓、心房水,、胸房水,、組織等。 
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人T細(xì)胞受體(TCR)ELISA分析檢測試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清,、血漿、組織勻漿,、細(xì)胞裂解液,、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類標(biāo)本：
包括血清,，血漿,，尿液，胸腹水,，腦脊液,，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清，如保存過程中如有沉淀,，請?jiān)俅坞x心,。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清,，如保存過程中有沉淀,，請?jiān)俅坞x心。
尿液：
用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀,，請?jiān)俅坞x心,。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,，通過反復(fù)凍融,，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清,，如保存過程中有沉淀,，請?jiān)俅坞x心。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后,，稱取重量,，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度,，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,，仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測,，其余冷凍備用,。

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ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度,，包被的溫度和時間,，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,，在4-8℃冰箱中放置過夜,，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和,?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的,。通常在ELISA板孔中加入包被液后,，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果,。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml,。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程,?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙,，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似,。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,，其zui大的特點(diǎn)是價廉,，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用,，但由于奶粉的成份復(fù)雜,，而且封閉后的載體不易*保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用,。 
封閉是否必要,，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉,，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高,。一般說來，雙抗體夾心法,，只要酶標(biāo)記物是高活性的,，操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果,。特別是用單抗腹水直接包被時,，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用,。但在間接法測定中,，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,，在低溫可保存數(shù)月,。