無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書/D1150/北京索萊寶

生產(chǎn)商：北京索萊寶

產(chǎn)品名稱：無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒

貨號：D1150

規(guī)格：10T

庫存：現(xiàn)貨

保存：常溫干燥保存,，復檢期為一年,。

無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明：

本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA,。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效,、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物,。 Solarbio公司研制的內(nèi)毒素清除劑,，可大限度地除去內(nèi)毒素。從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中,，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA,，提取率達85-90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA純度高,，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染等要求較高的實驗,，以及其他各種常規(guī)操作，包括酶切,、PCR、測序,、連接和轉(zhuǎn)化等試驗,。

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽,。溶液P1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入）,，混勻，置于 2-8℃保存,。如非指明,，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒操作步驟:

1,、取50-100ml細菌培養(yǎng)物,，11000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）,。

2,、向留有菌體沉淀的離心管中加入4ml溶液P1(請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀,。注意：如果菌塊未*混勻,，會影響裂解導致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

3,、向離心管中加入4ml溶液P2,，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和,，以免污染細菌基因組DNA,，此時菌液應變得清亮粘稠,，作用時間不要超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞,。

4,、向離心管中加入4ml溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次,，充分混勻,，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。11000rpm離心10 min,，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中,，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液P3加入后應立即混合,，避免產(chǎn)生局部沉淀,。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清,。

5,、加入上清1/5體積的冰上預冷的內(nèi)毒素清除劑，振蕩混勻,，溶液變渾濁,，冰浴2min至溶液變清亮。

6,、37℃水浴5min,不時振蕩,，溶液又變渾濁。11000rpm室溫離心5min,，溶液應分為兩相,，上層水相含質(zhì)粒DNA，下層油相含內(nèi)毒素,。

7,、將含質(zhì)粒DNA的上層水相轉(zhuǎn)移至新管，棄下層油相,，注意不要吸入油狀相,。重復抽提三次，即重復步驟5-7三次,。

8,、加入12ml的結(jié)合液，充分混勻后加入吸附柱中,，室溫放置2min,，11000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中,。如果溶液量多可分多次加入,。

9、向吸附柱中加入8ml漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),，11000rpm離心1min,，棄廢液，將吸附柱放入收集管中,。

10,、向吸附柱中加入6ml漂洗液，11000rpm離心1min,，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中。

11,、11000rpm離心3min,，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切,、PCR等。

12,、將吸附柱放入一個干凈的離心管中,，向吸附膜*懸空滴加1-2ml經(jīng)65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置5min,，11000rpm離心2min。

13,、為了增加質(zhì)粒的回收效率,，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min,，11000rpm離心2min,。

無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒注意事項:

1. 使用前請先檢查溶液P2、P3和結(jié)合液是否出現(xiàn)混濁,，如有混濁現(xiàn)象,，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用,。

2. 洗脫緩沖液體積不應少于1ml,，體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍),， pH值低于7. 0會降低洗脫效率,， DNA產(chǎn)物應保存在-20℃，以防DNA降解。

3. 質(zhì)粒DNA濃度＞1mg/ml時清除內(nèi)毒素效率降低,。由于質(zhì)粒DNA本身的性質(zhì),，清除過程可導致部分質(zhì)粒DNA丟失，但內(nèi)毒素卻能得到大限度清除,。

4. 所有溶液應用無內(nèi)毒素的高純水配制,，所有器械材料均應不含內(nèi)毒素，玻璃器皿可高溫烘烤,，非揮發(fā)性水溶液可高壓處理,。

5. DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān),。 得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度,。 DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50μg/ml雙鏈DNA,、 40μg/ml單鏈DNA,。OD260/OD280比值應為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,，而使用去離子水,，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值,，但并不表示純度低,。

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