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原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國

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史華進(jìn)冉良驥

隨著多肽合成技術(shù)的不斷發(fā)展和日趨成熟以及GLP-1受體激動(dòng)劑（如利拉魯肽和司美格魯肽）的走紅,，肽類藥物逐步成為眾多生物藥企重點(diǎn)關(guān)注的研發(fā)管線之一,。由于多肽分子大小介于傳統(tǒng)小分子化藥和蛋白類生物藥之間，因此具備兩者的一些特性,。為指導(dǎo)化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)的研究,，2月21日，國家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心發(fā)布《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》,，其在質(zhì)量研究與控制部分介紹了使用LCMS鑒別合成肽,。賽默飛單桿液質(zhì)在線除鹽結(jié)合解卷積功能以及完善的液相色譜產(chǎn)品及解決方案，可以助力肽類藥物的工藝研發(fā)及質(zhì)量研究和控制工作,。

寡肽定義 

寡肽一般指由2-20個(gè)氨基酸殘基通過肽鍵連接形成的生物活性肽,，通常也被稱作小肽，低聚肽或者小分子活性肽,。相較于小分子藥物,，寡肽藥物具有更好的靶向性,，而對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽，寡肽分子量更小,，結(jié)構(gòu)更簡單更容易滲透到目標(biāo)組織,。

合成肽中的雜質(zhì) 

固相肽合成技術(shù)因其效率高，操作簡單等優(yōu)勢(shì),，已成為主流的肽合成技術(shù),。合成過程中難免會(huì)形成相關(guān)雜質(zhì)，包括合成工藝中氨基酸丟失,，插入或錯(cuò)配,，以及脫酰胺,、氧化或異構(gòu)化等降解雜質(zhì),。

質(zhì)譜前端在線除鹽 

液相質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)作為現(xiàn)代常見的有機(jī)化合物定性手段,，已被廣泛用于合成路線中主化合物及有關(guān)雜質(zhì)鑒定。雖然目前為止,，TFA是主流的離子對(duì)試劑用于合成肽樣品分離,，不過對(duì)于有些難分離的化合物依然需要采用磷酸鹽體系改善分離。質(zhì)譜使用者都熟知,，像磷酸鹽這類不揮發(fā)性鹽不能直接進(jìn)入質(zhì)譜,，這對(duì)于直接用質(zhì)譜定性方法中的有關(guān)雜質(zhì)增加了難度。為了解決上述問題,，二維在線除鹽技術(shù)日趨流行,。一維色譜保留原不揮發(fā)性鹽體系方法，二維采用揮發(fā)性的流動(dòng)相將目標(biāo)物送入質(zhì)譜鑒定,。賽默飛雙三元液相色譜系統(tǒng)（圖1）,，采用獨(dú)特的雙泵設(shè)計(jì)，每個(gè)泵可作為一個(gè)單獨(dú)的運(yùn)行體系,，有各自獨(dú)立的比例閥和流動(dòng)相體系,，可同時(shí)分別控制三條流動(dòng)相流路，輕松實(shí)現(xiàn)二維在線除鹽功能,。

圖1：雙三元泵外觀

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雙三元二維在線除鹽方法設(shè)計(jì) 

采用雙三元二維液相色譜系統(tǒng)構(gòu)建的質(zhì)譜前端在線除鹽流路如圖 2 所示,，質(zhì)譜前端在線除鹽技術(shù)過程一般主要有三個(gè)步驟，主要利用柱溫箱上的兩個(gè)2位6通閥切換技術(shù),，控制不同流路間的聯(lián)動(dòng),。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)原來含有不揮發(fā)性鹽流動(dòng)相方法進(jìn)行重現(xiàn)，確定待切組分的出峰時(shí)間,，設(shè)定切閥時(shí)間,。由圖2可見，柱溫箱上閥帶有樣品收集環(huán),，本實(shí)驗(yàn)配置的樣品環(huán)為500 μL,，結(jié)合一維色譜流速為1.0 mL·min?1,，因此，最大的收集時(shí)間為0.5min,，通過閥切換技術(shù)可以將目標(biāo)組分（流動(dòng)相含有不揮發(fā)性鹽或離子對(duì)試劑）收集于環(huán)中,，非目標(biāo)組份可直接經(jīng)由閥排入廢液；然后收集好的組分會(huì)由配有質(zhì)譜兼容流動(dòng)相的雙三元左泵帶入在線除鹽小柱,，目標(biāo)組分先保留在除鹽柱上,，不揮發(fā)性鹽在除鹽柱上無保留，因此直接流入廢液,。最后，待鹽全部流穿后,，通過下閥閥切,，改變左泵梯度，將目標(biāo)組分帶入質(zhì)譜儀進(jìn)行定性分析,。

圖2 雙三元二維在線除鹽系統(tǒng)流路圖

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質(zhì)譜解卷積 

多肽分子使用電噴霧離子源（ESI）時(shí),，由于其存在多個(gè)潛在電荷位點(diǎn)，質(zhì)譜圖中會(huì)出現(xiàn)多個(gè)電荷對(duì)應(yīng)的不同m/z離子信號(hào),。通過這些離子峰不能直接獲取多肽分子的準(zhǔn)確分子量,。根據(jù)多電荷離子碎片的質(zhì)荷比推算單電荷多肽的分子量這一方法被稱為電荷解卷積，質(zhì)譜圖通過解卷積處理后可以直接獲得多肽的準(zhǔn)確分子量,。

儀器配置 

Vanquish Core系列液相色譜儀：

雙三元泵：VC-P33-A-01,；

自動(dòng)進(jìn)樣器：VC-A12-A-02；

柱溫箱：VC-C10-A-03（配置兩個(gè)2位6通閥,，500uLloop環(huán)）,；

DAD檢測器：VC-D11-A；

VWD檢測器：VC-D40-A,；

ISQ單桿質(zhì)譜檢測器,；

變色龍色譜管理軟件 Chromeleon CDS 7.3.1配備去卷積權(quán)限PN:7200.0046

結(jié)果與分析

按一維分析柱條件運(yùn)行一維色譜，可以得到一維紫外色譜圖,。如圖3所示,，主化合物出峰時(shí)間為35.947 min，在16.523 min處有一個(gè)雜質(zhì),，為此次實(shí)驗(yàn)研究雜質(zhì),。通過一維色譜圖可以確定樣品環(huán)的收集時(shí)間或閥切換時(shí)間，根據(jù)一維色譜出峰時(shí)間,，設(shè)定第一次切閥時(shí)間為16.3min,，即一維待測組分轉(zhuǎn)入樣品環(huán)，第二次閥切時(shí)間為16.8min,，即二維流動(dòng)相將組分帶入除鹽柱,，進(jìn)行在線除鹽,，然后待鹽除去后，設(shè)置下閥切閥時(shí)間并調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例,，將待測物轉(zhuǎn)入質(zhì)譜,。

圖3 寡肽樣品一維紫外檢測器色譜圖

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因質(zhì)譜不能使用不揮發(fā)性鹽流動(dòng)相，為盡可能降低其進(jìn)入后端質(zhì)譜風(fēng)險(xiǎn),，實(shí)驗(yàn)前期采用紫外檢測器研究切閥及二維色譜條件,，監(jiān)測待測物是否成功切入二維。由圖4可見,，按二維除鹽柱條件運(yùn)行二維色譜,，22分鐘前，在高比例水相條件下除去不揮發(fā)性鹽,，然后26分鐘提高有機(jī)相比例,，即將待測物成功轉(zhuǎn)入二維檢測器，在紫外檢測器中出鋒時(shí)間為26.94min,，且峰形良好,。

圖4 寡肽樣品二維紫外檢測器色譜圖

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待二維方法確認(rèn)后，將質(zhì)譜檢測器串聯(lián)到二維紫外檢測器后,，按照色譜及質(zhì)譜條件運(yùn)行系統(tǒng),，如圖5所示，在質(zhì)譜總離子流色譜（TIC）中,，待測雜質(zhì)峰出峰時(shí)間為27.0min且質(zhì)譜響應(yīng)較高,。

圖5寡肽樣品二維質(zhì)譜檢測器總離子流圖

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通過Chromeleon數(shù)據(jù)處理軟件去卷積功能，可通過去卷積算法,，將系列離子峰轉(zhuǎn)化為單個(gè)分子質(zhì)量,。圖6中展示了軟件通過算法可以獲得離子峰對(duì)應(yīng)的電荷數(shù)分布及該寡肽的分子量。

圖6 變色龍軟件去卷積處理后待測雜質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果

（1）進(jìn)樣序列,；（2）目標(biāo)組分列表,；（3）去卷積參數(shù)設(shè)置；（4）和（6）總離子流圖,；（5）全掃描質(zhì)譜圖,；（7）去卷積譜圖；（8）源質(zhì)譜圖,；（9）去卷積結(jié)果組成列表,。（點(diǎn)擊查看大圖）

小結(jié)

利用雙三元二維液相儀器，一個(gè)泵模塊,，可以發(fā)揮兩個(gè)泵的功能,，開展在線除鹽技術(shù)，操作簡單，節(jié)省臺(tái)面空間,。除鹽后,，組分可以直接進(jìn)入質(zhì)譜檢測器，進(jìn)行后續(xù)定性工作,。整個(gè)過程完全自動(dòng)化,，可以確保實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性，提高分析效率,，節(jié)省時(shí)間,。數(shù)據(jù)采集后，結(jié)合變色龍軟件質(zhì)譜去卷積功能,，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,，可以快速獲取寡肽樣品有關(guān)化合物的電荷分布及分子量結(jié)果。因此,，本研究可以輔助寡肽合成工藝,，獲取目標(biāo)峰分子量，為寡肽合成終點(diǎn)控制,，中間體控制,，雜質(zhì)確證,，合成路線優(yōu)化等工作提供指導(dǎo)意義,。

參考資料：

《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》

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