ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase,，ACL）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ACL（EC4.1.3.8）是脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶，其催化產(chǎn)生的乙酰fu酶 A 可用于脂肪酸合成和碳鏈延長(zhǎng),、黃酮類物質(zhì)合成,、氨基酸合成等。

測(cè)定原理：

ACL 在ATP 和fu酶A 存在的情況下催化檸檬酸裂解為乙酰fu酶 A,、草酰乙酸,、腺苷二磷酸和磷酸鹽。蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH 生成蘋果酸和NAD⁺,，在 340nm 測(cè)定NADH 減少速率,，計(jì)算 ACL 活性。

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組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì),、臺(tái)式離心機(jī),、水浴鍋、移液器,、1ml 石英比色皿,、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測(cè)定

（1） 工作液的配置，將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中,，充分混合溶解,，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃

（其它物種）水浴 5min；（注意：可取少量試劑一至試劑二和試劑三中,，充分混勻溶解后轉(zhuǎn)移至試劑一瓶中,，重復(fù) 2-3 遍）；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

（2） 在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 工作液，混勻,，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值A1和 2min20s 后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A1-A2。

ACL 活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1,、血清（漿）ACL 活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

ACL（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1608×ΔA 2、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中 ACL 活力計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

ACL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

ACL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.216×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1×10^-3 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm； V 樣：加入樣本體積,，0.05 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬。

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