葡萄糖-6-磷酸酶（G6P)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase,，G6Pase，EC 3.1.3.9）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和細胞中，是糖異生過程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶,，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用,。

測定原理：

G6P 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，變旋酶和葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NAD⁺還原生成NADH,，在 340nm 下測定NADH 生成速率,，即可反映 G6P 活性。

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組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

樣本前處理：

1,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復 30 次）,；8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1,、分光光度計預熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、工作液的配制：臨用前將試劑二、試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

3,、將工作液置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱 5 分鐘,。

4、在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 工作液,，立即混勻,，記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 2min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1,。

注意：在該試劑盒中,，若ΔA 大于 0.3，需將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后測定,，使ΔA 小于 0.3 可提高檢測靈敏度,。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

G6P 活性計算：

1,、血清（漿）G6P 活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1608×ΔA 2、組織,、細菌或細胞中 G6P 活力計算

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

G6P（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應(yīng)時間，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬,。

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